HBV感染相關的ADAR1基因功能研究.pdf

1、背景：乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)血源性感染是一個全球范圍內的健康問題，可造成慢性感染和慢性肝病，患者死于肝硬化和肝癌的風險很高。α干擾素(interferonα，IFNα)是臨床治療慢性乙型肝炎的最常用的藥物，可以顯著抑制HBV復制。研究證實α干擾素結合細胞表面受體，通過一系列信號轉導通路，激活下游抗病毒蛋白，包括RNA特異性腺苷脫氨酶（adenosine deaminases acting on RNA

2、，ADAR1）、粘病毒抵抗蛋白A GTP酶(myxovirus-resistant GTPase，MxA)等實現抗病毒作用。關聯研究發(fā)現ADAR1基因單核苷酸多態(tài)性(single nucleotidepolymorphisms，SNP)位點與IFN治療多發(fā)性硬化及慢性丙型肝炎療效相關，本實驗室前期研究也表明，ADAR1 rs4845384可能是IFNα治療慢性乙型肝炎無應答的相關因素，與乙肝病毒e抗原(hepatitis B e ant

3、igen，HBeAg)血清轉換和自發(fā)性及干擾素誘導的乙肝病毒表面抗原(hepatitis B surface antigen，HBsAg)清除相關。
　　ADAR1主要生物學功能是作為RNA編輯酶催化其底物dsRNA發(fā)生A-to-Ⅰ的脫氨反應，轉錄時I被讀為G，而發(fā)生核苷替換;還可利用獨立于編輯活性的RNA結合蛋白的功能發(fā)揮作用。研究表明，RNA編輯酶在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要功能，ADAR1的表達受到機體內源的調節(jié)因子miRN

4、As的調控，從而引起腫瘤的惡性化發(fā)展;另外，亦有研究發(fā)現其在不同種類的病毒感染中表現出促進病毒感染或抵抗病毒感染的作用。近年來有研究發(fā)現在丙型肝炎病毒感染時，ADAR1能抑制丙型肝炎病毒復制影響其活性，具有潛在的抗病毒機制。目前其在慢性乙肝中的作用報道很少，其作用和機制都存在爭議。
　　本研究在前期研究的基礎上，進一步探索ADAR1在HBV感染中的作用機制，為研究乙肝病毒的感染致病機制及治療乙肝提供新的基于ADAR1的靶點和策略。

5、
　　方法：在HeLa、SK-HEP-1、QGY-7703、HepG2、HepG2.2.15、Hep3B和SMMC-7721等7個細胞系中通過雙熒光素酶報告基因實驗揭示ADAR1 rs4845384多態(tài)性位點對報告基因活性的影響;構建ADAR1過表達質粒和shRNA發(fā)夾質粒，瞬時轉染HBV陽性細胞系HepG2.2.15以上調或下調ADAR1基因表達水平，ELISA和實時熒光定量PCR方法檢測上清中HBV標志物水平，驗證ADAR1在

6、HBV感染中是否發(fā)揮作用;構建ADAR1基因3'-UTR熒光素酶報告基因質粒，用microRNA.org-Targets andExpression、TargetScan、miRTarBase等網站預測與ADAR1基因相互作用的miRNAs并合成相關microRNA表達質粒，雙熒光素酶報告基因實驗篩選與ADAR1基因3'-UTR相互作用的miRNA以探討ADAR1基因在HBV感染中發(fā)揮作用的可能機制。
　　結果：
　　1.A

7、DAR1 rs4845384對報告基因活性的影響應用pGL3-rs4845384A和pGL3-rs4845384G表達質粒，瞬時轉染HepG2.2.15、HepG2等6個肝癌細胞系和HeLa非肝癌細胞系，雙熒光素酶報告基因實驗結果表明，pGL3-rs4845384G表達活性顯著高于pGL3-rs4845384A(P＜0.05)，尤其在HBV陽性細胞HepG2.2.15中。IFNα誘導處理后，報告基因活性均顯著升高。
　　2.ADA

8、R1與HBV感染相關的體外功能研究1)質粒構建成功構建了ADAR1兩種構型(p110，p150)的過表達質粒，以及篩選能夠特異結合并干擾ADAR1表達的shRNA，構建發(fā)夾質粒sh-ADAR1。瞬時轉染HepG2.2.15等細胞系，過表達及干擾效果良好。
　　2) HepG2.2.15上清HBV感染標志物的檢測瞬時轉染相關質粒72h后，ELISA實驗發(fā)現過表達ADAR1(p110/p150)后HBsAg和HBeAg均顯著上升(P＜

9、0.05)，干擾后均顯著下降(P＜0.05);提取上清HBV DNA，實時熒光定量PCR的研究結果表明，上調ADAR1表達后HBV DNA拷貝數顯著上升(P＜0.05)，下調其表達則HBV DNA拷貝數顯著減少(P＜0.05)。
　　3.與ADAR13'-UTR相互作用的microRNA初步篩選驗證初步篩選出與ADAR1基因3'UTR相互作用的7個miRNAs:hsa-miR-93，hsa-miR-143,hsa-miR-20b,

10、hsa-miR-20a,hsa-miR-613,hsa-miR-106a,hsa-miR-206。
　　結論：
　　1.SNP功能實驗提示，rs4845384 G等位基因報告基因活性較高，rs4845384可能通過調節(jié)ADAR1表達水平影響IFNα治療CHB的療效。
　　2.過表達及干擾ADAR1表達后HepG2.2.15上清中HBV標志物水平顯著升高及降低，ADAR1基因可能促進HBV病毒的復制和分泌。
　　3