蕨麻正丁醇部位對(duì)大鼠海馬神經(jīng)元缺氧損傷的保護(hù)作用及機(jī)制研究.pdf

1、目的：研究蕨麻正丁醇部位對(duì)大鼠海馬神經(jīng)元缺氧損傷的保護(hù)作用，并探討其可能機(jī)制。 方法：①采用清潔級(jí)新生SD大鼠(出生后24h之內(nèi))，分離海馬神經(jīng)元，進(jìn)行體外原代培養(yǎng)。MAP2免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定神經(jīng)元。②采用LDH檢測(cè)確定海馬神經(jīng)元的最佳缺氧時(shí)間，建立神經(jīng)元缺氧損傷模型。③通過(guò)MTT及LDH檢測(cè)確定蕨麻正丁醇部位高、中、低劑量組藥物濃度。細(xì)胞隨機(jī)分為正常對(duì)照組、缺氧損傷模型組、蕨麻正丁醇部位0.25mg/ml、0.0625mg/ml

2、、0.0156mg/ml干預(yù)組(缺氧同時(shí)加入蕨麻正丁醇部位)。④臺(tái)盼藍(lán)染色結(jié)合透射電鏡技術(shù)研究蕨麻正丁醇部位對(duì)缺氧損傷海馬神經(jīng)元形態(tài)及超微結(jié)構(gòu)的影響。⑤LDH檢測(cè)觀察不同劑量蕨麻正丁醇部位對(duì)海馬神經(jīng)元急性缺氧損傷的保護(hù)作用。⑥檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)超氧化物歧化酶(SOD)活性及脂質(zhì)過(guò)氧化代謝產(chǎn)物丙二醛(MDA)含量，研究蕨麻正丁醇部位對(duì)缺氧所致神經(jīng)元脂質(zhì)過(guò)氧化損傷的保護(hù)作用。⑦RT-PCR技術(shù)檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組caspase-9、caspase-3 mR

3、NA表達(dá)差異，免疫組織化學(xué)染色及WesternBlot檢測(cè)各組Cyt-c、Caspase-9、Caspase-3蛋白質(zhì)表達(dá)差異。 結(jié)果： 1.大鼠海馬神經(jīng)元的原代培養(yǎng)和形態(tài)學(xué)觀察：海馬神經(jīng)元在培養(yǎng)第7d分化成熟，相差顯微鏡下可見(jiàn)神經(jīng)元胞體豐滿，折光性強(qiáng)，胞核位于細(xì)胞中央或偏于一側(cè)，胞核及核仁清晰可見(jiàn)，神經(jīng)元突起粗大并相互交織成網(wǎng)。 2.神經(jīng)元鑒定：免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)培養(yǎng)細(xì)胞中神經(jīng)元特異性蛋白MAP2，神經(jīng)元陽(yáng)性

4、細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果顯示：神經(jīng)元純度達(dá)75.2±8.1％。 3.模型建立：海馬神經(jīng)元缺氧損傷0～3h，細(xì)胞活性變化幅度最大，單位時(shí)間內(nèi)細(xì)胞缺氧損傷程度最大，確定3h為最佳缺氧時(shí)間點(diǎn)。MTT法及LDH活性檢測(cè)確定藥物高、中、低濃度分別為0.25mg/ml、0.0625mg/ml、0.0156mg,/ml。 4 蕨麻正丁醇部位對(duì)體外培養(yǎng)大鼠海馬神經(jīng)元缺氧損傷的保護(hù)作用：(1)MTT:高、中劑量蕨麻正丁醇部位干預(yù)組可提高缺氧神經(jīng)元存活

5、率(P＜0.01)，而低劑量蕨麻正丁醇部位干預(yù)組與模型組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差別(P＞0.05)。(2)臺(tái)盼藍(lán)染色：蕨麻正丁醇部位可減少藍(lán)染死細(xì)胞數(shù)量。(3)透射電鏡：蕨麻正丁醇部位干預(yù)后，缺氧所致胞膜破裂、線粒體膜及嵴融合、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脫顆粒、間質(zhì)水腫等超微結(jié)構(gòu)損傷均減輕。(4)生化指標(biāo)：蕨麻正丁醇部位各劑量組可降低缺氧損傷神經(jīng)元LDH外漏量(P＜0.01)。 5 蕨麻正丁醇部位對(duì)海馬神經(jīng)元缺氧損傷保護(hù)作用的機(jī)制研究：(1)生化檢測(cè)：蕨

6、麻正丁醇部位干預(yù)組與模型組相比，可提高體外培養(yǎng)細(xì)胞外液中SOD活力(P＜0.01)；但各組MDA含量無(wú)顯著差異。(2)免疫組化染色：高、中、低劑量蕨麻正丁醇部位干預(yù)組與模型組相比，可降低海馬神經(jīng)元Cyt-c蛋白表達(dá)(P＜0.01)。高、中、低劑量蕨麻正丁醇部位干預(yù)組與模型組相比，可降低海馬神經(jīng)元Caspase-9蛋白表達(dá)(高、中劑量組P＜0.01；低劑量組P＜0.05)。高、中劑量蕨麻正丁醇部位干預(yù)組與模型組相比，可降低海馬神經(jīng)元Cas

7、pase-3(P＜0.01)蛋白表達(dá)。而低劑量蕨麻正丁醇部位干預(yù)組與模型組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差別(P＞0.05)。(3)RT-PCR；高、中、低劑量蕨麻正丁醇部位組與模型組相比，均可在mRNA水平降低缺氧海馬神經(jīng)元caspase-9表達(dá)(高、中劑量組P＜0.01；低劑量組P＜0.05)。模型組caspase-3 mRNA水平表達(dá)量較C組升高，高、中、低劑量蕨麻正丁醇部位組均可降低caspase-3 mRNA水平表達(dá)(P＜0.01)。(4)We

8、stern Blot：高、中、低劑量蕨麻正丁醇部位組與模型組相比，均可在蛋白水平降低缺氧海馬神經(jīng)元Cyt-c表達(dá)(P＜0.01)。模型組Caspase-9、Caspase-3表達(dá)量較C組升高，高、中、低劑量蕨麻正丁醇部位組均可降低Caspase-9、Caspase-3表達(dá)量(其中高、中劑量組P＜0.01)。 結(jié)論：蕨麻正丁醇部位能夠減輕缺氧對(duì)體外培養(yǎng)大鼠海馬神經(jīng)元的損傷，減輕細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)損傷程度、減少缺氧損傷后LDH的釋放，對(duì)體