黃瓜綠斑駁花葉病毒、番茄環(huán)斑病毒及南方菜豆花葉病毒的分子檢測(cè)技術(shù)研究.pdf

1、以遼寧蓋州地區(qū)表現(xiàn)黃瓜綠斑駁花葉病毒(CGMMV-LN)癥狀的西瓜葉片為材料，以總RNA為模板，通過(guò)RT-PCR擴(kuò)增獲得了CGMMV-LN的四段部分重疊并覆蓋全長(zhǎng)的片段。序列分析結(jié)果表明：CGMMV-LN全長(zhǎng)基因由6422個(gè)堿基組成，cp基因由486個(gè)堿基組成，編碼161個(gè)氨基酸，與已報(bào)道的其他11個(gè)CGMMV分離物相同。核苷酸序列同源性在90％以上，氨基酸序列同源性高于98％。CGMMV-LN的3'NTR由176個(gè)堿基組成，與CGMM

2、V-KW、CGMMV-SH和CGMMV-KOM的堿基數(shù)目相同，但比CGMMV-W多1個(gè)堿基。與其他3種Tobamovirus屬病毒3'NTR末端的17個(gè)堿基則完全一致，3'NTR序列的高度保守性有助于基因組末端RT-PCR引物的設(shè)計(jì)。 以引自加拿大的ToRSV懸鉤子分離物(TORSV_Ra)接種番杏發(fā)病后為試材，以總RNA為模板，采用RT-PCR方法擴(kuò)增病毒復(fù)制酶基因(RdRp)的cDNA片斷并將其克隆到pMD18-T載體上。序

3、列測(cè)定結(jié)果表明：Rasp-2 RdRp基因由2133個(gè)核苷酸組成，編碼711個(gè)氨基酸；Rasp-2半胱氨酸蛋白酶和RdRp之間的蛋白酶切割位點(diǎn)為Q/v。Rasp-2與其他分離物及株系RdRp的核苷酸序列同源性為79％．84％，氨基酸序列同源性為89％-94％。聚類分析結(jié)果顯示，葡萄黃脈株系(GYV)與其他分離物及株系關(guān)系最遠(yuǎn)，Rasp-2與其他分離物及株系親緣關(guān)系較近。證實(shí)Rasp-2與另外2個(gè)懸鉤子分離物Rasp和Rasp-1的核苷酸

4、序列存在明顯變異。 以來(lái)自甘肅感染CGMMV的南瓜果實(shí)為試材，以總RNA為模板，根據(jù)CP設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增。結(jié)果表明：本試驗(yàn)所建立的RT-PCR檢測(cè)方法可擴(kuò)增出目標(biāo)片段，將其CP序列與來(lái)自國(guó)內(nèi)不同地區(qū)的其他CGMMV分離物進(jìn)行序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)國(guó)內(nèi)各分離物間的同源性為97％-99％，證明有很近的親緣關(guān)系。 采用RT-PCR方法克隆了CGMMV-LN的CP基因并連接到原核表達(dá)載體pGEX-4T-3和pET-22b(

5、+)上，將獲得的重組子pGEX-4T-3-CGMMV CP和pET-22b(+)-CGMMV CP轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21后用IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。SDS-PAGE和Western blot分析表明，CP基因在大腸桿菌中獲得了高效表達(dá)，融合蛋白分子量分別為43.8 kDa和17.3 kDa。將17.3 kDa融合蛋白純化后免疫家兔，制備了CGMMV特異性抗血清，抗原包被間接ELISA法(ACP-ELISA)測(cè)定抗血清的效價(jià)為1/20,000

6、。 分別將CGMMV-LN和SBMV-J(日本分離物)的CP基因連接至病毒載體p45p46上，得到了相應(yīng)的重組載體pPVXCGMMV-CP和pPVXSBMV-CP。以線性化的空載體以及重組載體為模板進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄，并將體外轉(zhuǎn)錄物接種至本生煙葉片。與空載體p45p46接種的植株對(duì)比，pPVXCGMMV-CP和HpPVXSBMV-CP均表現(xiàn)為加重的系統(tǒng)花葉癥狀。通過(guò)RT-PCR擴(kuò)增檢測(cè)到了CGMMV-CP和SBMV-CP基因。將CGM

7、MV-LN的CP基因和3’NTR連接至載體pGEM-3Zf上，得到相應(yīng)的重組載體pGEMCGMMV-CP-3’NTR。以線性化的重組載體為模板進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄，并以體外轉(zhuǎn)錄的RNA和總RNA為模板，建立了CGMMV的實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)方法?？俁NA的檢測(cè)低限是0.13 Pg；體外轉(zhuǎn)錄RNA的檢測(cè)低限是0.03 pg，相當(dāng)于13764 copies/μL。 以南方菜豆花葉病毒日本分離物(SBMV-J)總RNA為模板，采用RT-P