桑樹(shù)植物化學(xué)成分及活性研究.pdf

1、本研究利用中國(guó)科學(xué)院植物化學(xué)及西部植物資源持續(xù)利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室的先進(jìn)儀器設(shè)備條件及多種柱層析、分子篩、重結(jié)晶等分離純化技術(shù)，對(duì)目前生產(chǎn)上大量推廣的人工三倍體新桑品種嘉陵20號(hào)的枝條和葉片進(jìn)行植物化學(xué)成分研究，并對(duì)所分離的化合物進(jìn)行抗腫瘤、抗骨質(zhì)疏松等多種生物活性檢測(cè)，從中篩選出含量較高、生物活性較好的桑樹(shù)活性成分；同時(shí)對(duì)西南大學(xué)蠶學(xué)及生物技術(shù)學(xué)院的桑樹(shù)種質(zhì)資源進(jìn)行多種生物活性篩選，篩選出生物活性較好的桑樹(shù)種質(zhì)資源，為今后深度開(kāi)發(fā)利用奠

2、定基礎(chǔ)。經(jīng)過(guò)試驗(yàn)研究，得到如下主要結(jié)果： 1.人工三倍體新桑品種嘉陵20號(hào)葉片的化學(xué)成分及活性研究。 本研究從人工三倍體新桑品種嘉陵20號(hào)葉片中分離出3個(gè)無(wú)機(jī)鹽和22個(gè)有機(jī)化合物。確定了這22個(gè)有機(jī)物中15個(gè)的分子結(jié)構(gòu)，它們分別為：scoplin分子量為354，分子式為C16H18O9；choline分子量為104，分子式為C5H14NO;norartocarpetin分子量為286，分子式為C15H10O6；scopl

3、etin分子量為192，分子式為C10H8O4；daucosterol分子量為576，分子式為C35H60O6；morachalconeA分子量為340，分子式為C20H20O5;quercitrin分子量為464，分子式為C21H20O12；squalene分子量為410，分子式為C30H50；β-carotene分子量為536，分子式為C40H56；esculetin分子量為178，分子式為C9H6O4；quercetin分子量為3

4、02，分子式為C15H10O7；deoxylutein分子量為550，分子式為C40H54O；β-sitostero1分子量為414，分子式為C29H50O；lutein分子量為568，分子式為C40H56O2；phytol分子量為296，分子式為C20H40O。 將這15個(gè)化合物中的12個(gè)(scoplin、choline、norartocarpetin、scopletin、morachalconeA、quercitrin、sq

5、ualene、β-carotene、esculetin、quercetin、lutein、phytol)送至中科院昆明植物研究所植物化學(xué)及西部植物資源持續(xù)利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室活性篩選室，利用CCLT模型(抗腫瘤模型)進(jìn)行抗腫瘤生物活性體外篩選試驗(yàn)。通過(guò)采用磺酰羅丹明B(sulforhodamineB，SRB)蛋白染色法，針對(duì)A549(人非小細(xì)胞肺癌)、BGC-7901(人胃癌)、B16(鼠黑色素瘤)、U251(人神經(jīng)膠質(zhì)瘤)4個(gè)人源腫瘤細(xì)

6、胞株對(duì)這些化合物進(jìn)行活性篩選。結(jié)果顯示，查耳酮morachalconeA對(duì)人非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞株具有一定的抑制作用，在濃度為10.00μg/ml時(shí)，其抑制率為64.159﹪，比陽(yáng)性對(duì)照紫杉醇的抑制率(53.671﹪)還高；查耳酮morachalconeA和葉黃素(1utein)都對(duì)鼠黑色素瘤細(xì)胞株(B16)具有一定的抑制作用，在濃度為10.00μg/ml時(shí)，morachalconeA的抑制率為52.534﹪，略低于葉黃素的抑制率(

7、64.910﹪)，但這兩者的抑制率都稍低于陽(yáng)性對(duì)照紫杉醇的抑制率(68.252﹪)。 本實(shí)驗(yàn)還對(duì)嘉陵20號(hào)葉片的活性物質(zhì)—桑葉多糖進(jìn)行了提取分離研究。采用水煮2～3個(gè)小時(shí)醇浸提后所剩殘?jiān)?，濾液3000D的透析袋逆流透析，無(wú)水乙醇沉淀的方法，對(duì)嘉陵20號(hào)葉中的多糖進(jìn)行提取分離，得率為4﹪左右。 2.人工三倍體嘉陵20號(hào)枝條化學(xué)成分及活性研究。 對(duì)人工三倍體新桑品種嘉陵20號(hào)枝條的化學(xué)成分進(jìn)行提取分離，共分離出4個(gè)無(wú)

8、機(jī)鹽，15個(gè)有機(jī)化合物，確定了這15個(gè)化合物中10個(gè)的化學(xué)結(jié)構(gòu)，它們分別為：β-sitosterol分子量為414，分子式為C29H50O；scoplin分子量為354，分子式為C16H18O9；sucrose分子量為342，分子式為C12H22O11；succinicacid分子量為118，分子式為C4H6O4；choline分子量為104，分子式為C5H14NO；mulberrosideA分子量為568，分子式為C26H32O14；

9、scopletin分子量為192，分子式為C10H8O4；DadaholA分子量為698，分子式為C30H38O12；daucosterol分子量為576，分子式為C35H60O6；hexacosanoicacid分子量為396，分子式為C26H52O2。 分別對(duì)粗提物萃取浸膏和分離得到的化合物進(jìn)行了生物活性篩選。 利用針對(duì)3種腫瘤細(xì)胞進(jìn)行的抗腫瘤模型CCLT(A549、HT-29、BGC-823)和針對(duì)疾病的分子靶標(biāo)進(jìn)

10、行的分子水平篩選的抗腫瘤模型(CDC25)、2個(gè)抗骨質(zhì)疏松模型(CAT-K、CAT-B)、影響代謝(PPⅠ)、溶血栓(PAI))共6個(gè)模型8個(gè)實(shí)驗(yàn)，采用ELISA法對(duì)粗提物萃取浸膏進(jìn)行了活性篩選，結(jié)果顯示：樣品石油醚萃取部分、氯仿萃取部分均對(duì)蛋白磷酸酶(CDC25)有一定的抑制作用，IC50值分別是66.78μg/ml、43.96μg/ml；氯仿萃取部分對(duì)組織蛋白酶B和組織蛋白酶K都具有抑制作用，IC50值分別為4.75μg/ml和4.

11、99μg/ml，活性較好。 將從嘉陵20號(hào)枝條中分離得到的mulberrosideA、dadaholA利用CCLT模型(抗腫瘤模型：A549(人非小細(xì)胞肺癌)、BGC-7901(人胃癌)、B16(鼠黑色素瘤)、U251(人神經(jīng)膠質(zhì)瘤)4個(gè)人源腫瘤細(xì)胞株進(jìn)行抗腫瘤生物活性體外篩選試驗(yàn)，以Taxol為陽(yáng)性對(duì)照，發(fā)現(xiàn)在濃度在10μg/ml的情況下，mulberrosideA對(duì)B16(鼠黑色素瘤)的抑制率為75.238﹪，IC50為9.

12、35μg/ml，其抑制率比陽(yáng)性對(duì)照紫杉醇(68.252﹪)高。 從15Kg的嘉陵20號(hào)枝條(干物)中共分離獲得20.025g的mulberrosideA，得率約為0.13﹪。這一試驗(yàn)結(jié)果，說(shuō)明該桑品種枝條中的mulberrosideA具有很好的開(kāi)發(fā)應(yīng)用前景，為嘉陵20號(hào)桑枝條的深度開(kāi)發(fā)探索出了新途徑，但需進(jìn)一步研究?jī)?yōu)化其分離提取工藝。 3.桑種質(zhì)資源的生物活性篩選。 利用針對(duì)3種腫瘤細(xì)胞進(jìn)行的抗腫瘤模型CCLT(

13、A549、HT-29、BGC-823)和針對(duì)疾病的分子靶標(biāo)進(jìn)行的分子水平篩選的抗腫瘤模型(CDC25)、2個(gè)抗骨質(zhì)疏松模型(CAT-K、CAT-B)、影響代謝(PPⅠ)、溶血栓(PAI)共6個(gè)模型8個(gè)實(shí)驗(yàn)，采用ELISA法對(duì)本?，F(xiàn)有的包括野生資源在內(nèi)的39個(gè)資源的葉片粗提浸膏進(jìn)行生物活性篩選。結(jié)果顯示：藥桑、古華桑6X、城口4號(hào)、育二號(hào)葉的乙醇粗提物浸膏對(duì)蛋白磷酸酶(CDC25)有一定的抑制作用，IC50分別為59.08μg/ml、67

14、.47μg/ml、77.37μg/ml、37.91μg/ml，說(shuō)明這些種質(zhì)資源中含有抗CDC25的化合物存在。這為以后桑種質(zhì)資源中抗腫瘤活性化學(xué)成分的分析研究奠定了基礎(chǔ)。 4.桑葉多糖的提取分離技術(shù)的研究本研究發(fā)現(xiàn)，采用95﹪的乙醇浸提5-6次，然后將過(guò)濾后的殘?jiān)盟螅^(guò)濾，透析袋逆流透析，再用乙醇沉淀的方法較好。該方法只使用價(jià)格便宜、對(duì)人身傷害較小的乙醇，其成本較低，且環(huán)保安全。試驗(yàn)結(jié)果還顯示，是否使用蛋白酶處理，多糖得率幾