磁共振預(yù)定位靶向成像技術(shù)對荷人結(jié)腸癌裸鼠模型成像的實驗研究.pdf

1、目的 1、使用經(jīng)羥基丁二酰亞胺活化的生物素-N-羥基丁二酰亞胺酯(biotinl-N-hydroxysuccinimideester,B-NHS)進(jìn)行單抗CL3的標(biāo)記，并測定生物素化單抗B-CL3的結(jié)合活性、生物素分子偶聯(lián)數(shù)。 2、以DTPA環(huán)酐法對鏈霉親和素(SA)進(jìn)行Gd3+的標(biāo)記，并測定成品SA-DTPA-Gd的SA活性單位、生物素結(jié)合特性、標(biāo)記的Gd3+數(shù)目和SA-DTPA-Gd對水分子r1馳豫率影響。

2、3、通過生物素化單抗B-CL3、親和素(Avidin)和SA-DTPA-Gd序貫注射對荷人結(jié)腸癌裸鼠模型增強效果的研究，探討生物素和親和素/鏈霉親和素系統(tǒng)(BiotinandAvidin/StrapavidinSystem，BAS)介導(dǎo)的磁共振預(yù)定位靶向成像技術(shù)對微小腫瘤的診斷價值；通過靜脈和腹腔注射生物素化單抗CL3-B在瘤內(nèi)形成不同分布模式的鏈霉親和素(SA-DTPA-Gd)結(jié)合位點，注射鏈霉親和素(SA-DTPA-Gd)后兩組增強

3、效果的對照研究探討腫瘤內(nèi)結(jié)合位點分布模式對靶向物質(zhì)在腫瘤內(nèi)分布的影響。 材料和方法 1.生物素化單克隆抗體的制備。 CL3用0.1mol/L、PH7.4NaHCO3緩沖液稀釋至濃度為1mg/ml；B-NHS用DMSO稀釋成20mg/ml(約58.6mmol/l)。取Cl-3溶液1ml，以摩爾比NHS-Biotin：CL3=20∶1反應(yīng)，反應(yīng)時一邊攪拌一邊在抗體溶液中緩慢加入20mg/ml的biotin溶液并充分混

4、合，將此溶液室溫下混合并緩慢攪拌或振蕩.2小時，而后在4℃與0.1mol/L、PH8.0NaHCO3緩沖液透析以除去游離的BNHS。 采用HABA法測定抗體的生物素化程度。將0.1ml，濃度為1mg/ml生物素化的抗體加入1ml的Avidin-HABA，室溫下孵育10min并計算500nm處的吸光值的下降并推算出生物素分子結(jié)合數(shù)。 CL-3抗體生物素化后抗體活性的測定采用細(xì)胞ELISA法。將濃度為1.0×106-7/ml

5、的LoVo細(xì)胞以每孔200ul接種于96孔板，4℃過夜培養(yǎng)，待細(xì)胞長滿時棄去培養(yǎng)液，Hank，s液洗去殘留培養(yǎng)基。用固定液0.05％戊二醛固定細(xì)胞30min，PBS-Twen洗滌5分鐘×3次。加入生物素化CL337℃孵育1.5小時，并設(shè)陽性對照(純化CL-3)和空白對照。加入1∶500稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG，37度反應(yīng)1.5小時。加鄰苯二胺-雙氧水(OPD-H2O2)底物200ul，37℃閉光反應(yīng)30min，加NH2SO

6、4終止反應(yīng)，選取波長490nm，空白調(diào)零后測定各孔OD值。根據(jù)OD值計算抗體比活性。 2.鏈霉親和素(SA)-DTPA-Gd的制備及其鑒定 由于DTPA環(huán)酐(cDTPA)在水中迅速水解，因而稱取cDTPA35.7mg(0.1mmol)溶于1mlDMSO。稱取1mgSA(約0.0167umol)并加入15ul0.1MNaHCO3緩沖液(PH=8)。將上述15ul的SA溶液與80ul的cDTPA溶液(0.1M)室溫下混合1h

7、后加入1ml0.0069M的GdCl3。在室溫下反應(yīng)5分鐘后將混合液移入微孔濾膜離心管離心去除未結(jié)合的Gd3+離子(5000轉(zhuǎn)，2次)。然后將溶液定容至約1ml，其中SA濃度為1mg/ml。成品在4℃下保存?zhèn)溆?，使用時以生理鹽水將SA-DTPA-Gd稀釋至相應(yīng)濃度。 3、CL3-DTPA-Gd的制備 將1mgcDTPA溶于無水二甲亞砜，加入單克隆抗體CL3(2mg，1ml)，cDTPA與單克隆抗體的摩爾比約為30∶1，室

8、溫下孵育45分鐘。完成偶聯(lián)反應(yīng)后再加入GdCl3，絡(luò)合反應(yīng)1分鐘后，用離心超濾法除去游離的Gd3+和DTPA。使用0.1MpH8.0NaHCO3緩沖液將CL3-DTPA-Gd調(diào)至0.25mmol/l備用。 4、動物實驗部分 將處于對數(shù)生長期的LOVO結(jié)腸癌細(xì)胞(1×106-7/ml)植入5-7周齡、體重約20～25gBALB/C裸鼠(第一軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心提供)頸背部皮下，4-7周后待腫瘤直徑生長至1cm左右時用于本實

9、驗。 10只荷人結(jié)腸癌裸鼠隨機(jī)分為2組行單抗直接標(biāo)記Gd3+的強化研究：B-CL3靜脈注射組和B-CL3腹腔注射組，因而5只裸鼠靜脈注射0.03μmol的CL3-DTPA-Gd(120ul，0.25mM)，5只裸鼠腹腔注射0.03μmol的CL3-DTPA-Gd(120ul，0.25mM)。靜脈預(yù)定位組中首先靜脈注射生物素化的CL3(B-CL3)其中7只經(jīng)尾靜脈注射生物素化的CL3600ug，7只經(jīng)腹腔注射生物素化的CL3600

10、ug。24小時后14只裸鼠腹腔注射作為追捕劑的親和素80ug，再30min后分別經(jīng)尾靜脈注射0.01mmol的SA-DTPA-Gd0.2ml。其余6只經(jīng)尾靜脈注射0.15mmol/l的Gd-DTPA溶液約0.2ml。 采用SiemensMagnetomVision1.5T超導(dǎo)型掃描儀。平掃及增強掃描序列為SET1WI500ms/15ms,T2WI4000ms/98ms.，冠狀位或斜矢狀位。FOV為160×160mm，矩陣256×

11、256，層厚3mm。 單抗直接標(biāo)記成像研究中于注射CL3-DTPA-Gd后24h進(jìn)行MR掃描。MR預(yù)定位靶向成像的研究中各實驗組在注射對比劑前、后20'、60'、3h、6h、9h、12h和24h分別進(jìn)行MR掃描。 統(tǒng)計學(xué)分析采用軟件SPSS13.0進(jìn)行。單抗直接標(biāo)記Gd3+的強化研究中兩組腫瘤強化率差異采用獨立樣本t檢驗；MR預(yù)定位成像中不同組間信號強度差異采用重復(fù)測量的方差分析(RepeatMearsuresANOVA

12、)；不同組間腫瘤和肝臟峰值強化率采用單因素方差分析(One-wayANOVA)；B-CL3靜脈預(yù)定位組和腹腔預(yù)定位組間強化均勻性分析采用兩獨立樣本非參數(shù)檢驗；P＜0.05認(rèn)為具有統(tǒng)計學(xué)差異。 結(jié)果 1.單克隆抗體CL3經(jīng)與活性生物素酯NHS-B反應(yīng)，每個抗體分子平均可結(jié)合3.5個分子的生物素，其抗體結(jié)合活性約為93.6％。 2.SA-DTPA-Gd溶液中加入0.1ug/ul的生物素共40ul后OD233值達(dá)到飽和

13、，SA-DTPA-Gd的SA活性為13.3。每分子SA-DTPA-Gd可結(jié)合4個生物素分子；SA-DTPA-Gd復(fù)合物中SA分子與Gd離子數(shù)目比約為1∶13.3。室溫下SA-DTPA-Gd溶液的r1馳豫率為8.10，而相同濃度下Gd-DTPA溶液r1馳豫率為4.49。 3.CL3-DTPA-Gd靜脈和腹腔注射組24小時后的腫瘤強化程度并無顯著性差異。然而兩組中瘤內(nèi)滲透曲線具有不同的形態(tài)：靜脈注射組中腫瘤由表面至中央的光密度基本均

14、勻一致，而腹腔注射組中腫瘤邊緣光密度值較高，向腫瘤中心則光密度逐漸下降。 4.生物素化單抗BCL3靜脈預(yù)定位組在SA-DTPA-Gd靜脈注射后腫瘤組織早期為逐漸強化，信號逐漸上升，至6h腫瘤信號達(dá)到最高，信號強度達(dá)622.9±23.2，強化率為74.8±5.5％，并與其他時間點均具有顯著統(tǒng)計學(xué)差異；掃描延遲至24h仍可見腫瘤組織明顯強化，信號強度達(dá)518.8±20.7，強化率為45.6％±2.9％。 5.各組中腫瘤和肝臟

15、峰值強化率的比較 各組中腫瘤和肝臟峰值強化率的比較顯示CL3靜脈預(yù)定位組和CL3腹腔預(yù)定位組中腫瘤組織均于第6小時達(dá)到峰值強化，而Gd-DTPA組中20分鐘時腫瘤信號強度最高。單因素方差分析多重比較顯示Gd-DTPA組峰值強化率高于其余兩組并具有顯著性差異，而CL3靜脈預(yù)定位組雖然腫瘤峰值強化的信號增加值和強化率均高于CL3腹腔預(yù)定位組，但兩組間無顯著性差異。 6.SA-DTPA-Gd靜脈注射后各組中腫瘤強化均勻性比較：

16、 SA-DTPA-Gd靜脈注射后各組中腫瘤強化均勻性比較顯示20min時CL3靜脈組和腹腔注射組中分別有2枚和3枚腫瘤判斷為無強化，因而未參加均勻性比較；CL3靜脈預(yù)定位組在SA-DTPA-Gd靜脈注射后6小時4個樣本為均勻強化，3個為彌漫不均勻強化，而CL3靜脈組中僅有3枚為彌漫不均勻強化，兩者具有顯著統(tǒng)計學(xué)差異；9小時、12小時和24小時后CL3靜脈組均有5個以上樣本為均勻強化，而CL3腹腔組中僅在24小時有3個樣本為均勻強

17、化，其余均為彌漫不均勻強化和環(huán)型強化，兩組間具有顯著統(tǒng)計學(xué)差異；其余時間點(1、3小時)兩組的強化均勻度均無顯著統(tǒng)計學(xué)差異。 結(jié)論 1.單克隆抗體CL3在結(jié)合3.5個生物素分子后，仍可保持較高的抗原結(jié)合活性。 2.在PH=8，SA和cDTPA摩爾比為1∶500時使用DTPA環(huán)酐法可在SA上結(jié)合14-15個Gd3+，合成的SA-DTPA-Gd的生物素活性單位為13.3；SA-DTPA-Gd體外r1馳預(yù)率為18.1，