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文檔簡介
1、目的:(1)制備負載油性SPIO、水性SPIO聚合物納米囊泡;(2)驗證負載油性SPIO、水性SPIO聚合物納米囊泡的理化特征;(3)體外細胞實驗驗證負載油性SPIO、水性SPIO聚合物納米囊泡標(biāo)記人結(jié)腸癌細胞(LoVo)并進行MRI成像的可能性;(4)動物實驗驗證負載油性SPIO、水性SPIO聚合物納米囊泡對結(jié)腸癌的MRI顯像能力。
方法:⑴經(jīng)多步化學(xué)反應(yīng)得到的生物可降解共聚物PEG-PDLLA(聚乙二醇-聚(D,L-丙
2、交酯)),通過多次乳化及溶劑揮散法使共聚物在水溶液中自組裝成囊泡,在PEG-PDLLA聚合物囊泡中分別負載油性和水性SPIO;(2)掃描電鏡(Scanningelectron microscopy,TEM)和透視電鏡(Transmission electron microscopy,TEM)觀察負載油性、水性SPIO聚合物納米囊泡的直徑、形態(tài)、分布;(3)MR測量相同SPIO濃度的單純SPIO膠體液、負載油性、水性SPIO聚合物納米囊泡
3、的T2馳豫率(1/T2);(4)體外培養(yǎng)人結(jié)腸癌細胞(LoVo)和人正常胎肝細胞(L-o2),使細胞量達1×106/mL,同時加入不等量的負載油性、水性SPIO聚合物納米囊泡(25μg、50μg、100μg、200μg),分別培養(yǎng)1h、3h、6h后,用MR測量T2馳豫率;比較負載SPIO聚合物納米囊泡對LoVo和人正常胎肝細胞(L-o2)的標(biāo)記能力;(5)MTT(Methyl thiazolyl tetrazolium)實驗和胎盼藍染色
4、觀察負載SPIO聚合物囊泡的細胞毒性;(6)建立荷人結(jié)腸癌裸鼠移植瘤模型;(7)荷瘤動物實驗:18只裸鼠分為三組,每組6只,分別從尾靜脈注射三種對比劑(單純SPIO膠體液、負載油性SPIO、水性SPIO聚合物納米囊泡),注射劑量為2.5mg Fe/Kg,行動態(tài)MRI掃描(0h、0.5h、1h、3h、6h、12h、24h、48h)觀察腫瘤、肝臟、肌肉的T2WI信號改變。⑺采用T2WI和T2 map掃描序列,用T2 mapping軟件測量T
5、2值。⑻細胞實驗和動物實驗結(jié)束后,用電鏡檢查和普魯士藍染色驗證SPIO是否進入腫瘤細胞,用普魯士藍染色計算標(biāo)記率。
結(jié)果:
①油性SPIO或水性SPIO分別負載于聚合物囊泡的中心膜及親水內(nèi)腔中,兩者的平均直徑分別為182.2nm、191.7nm。TEM顯示油性SPIO均勻地分散于囊泡的中心膜上;水性SPIO以“團簇”的形式被包裹在囊泡的內(nèi)腔中。負載了SPIO的聚合物囊泡沒有改變自由SPIO的超順磁性特征。和單
6、純SPIO膠體液相比,負載SPIO聚合物囊泡表現(xiàn)出超高MRI敏感性。在相同鐵離子濃度下,負載水性SPIO聚合物囊泡的T2馳豫率(1/T2)表現(xiàn)出高于負載油性SPIO聚合物納米囊泡的T2馳豫率。
②負載SPIO聚合物納米囊泡標(biāo)記細胞時,在106/mL水平的細胞量,即可被MRI檢出;負載油性SPIO聚合物囊泡在與LoVo細胞培養(yǎng)后6h,即可引起肉眼所見的信號下降;負載水性SPIO聚合物囊泡與細胞培養(yǎng)后3h,即可發(fā)現(xiàn)信號下降;而
7、且相同濃度的負載水性SPIO聚合物囊泡標(biāo)記細胞后比負載油性SPIO聚合物囊泡引起的T2馳豫率更高。負載SPIO聚合物納米囊泡標(biāo)記LoVo細胞比標(biāo)記L-o2細胞引起的T2馳豫率更高。普魯士藍染色顯示LoVo細胞漿內(nèi)出現(xiàn)藍色顆粒,標(biāo)記率在75%以上。電鏡切片觀察可見高密度鐵顆粒位于細胞漿內(nèi)。
③MTT試驗:各種濃度的負載SPIO聚合物囊泡與L-o2細胞混合培養(yǎng)后,各OD(Optical density)值之間無統(tǒng)計學(xué)差異;胎盼
8、藍染色試驗表明不同濃度SPIO聚合物囊泡標(biāo)記細胞后,細胞的活力在95%以上。
④動物實驗:尾靜脈注射負載SPIO聚合物納米囊泡能引起腫瘤T2WI信號下降,注射后1~6h為明顯,最大值下降約11.4%,單純SPIO膠體液則未能引起腫瘤信號下降,三種對比劑引起的信號下降有統(tǒng)計學(xué)差異(p<0.01),但負載油性和水性SPIO聚合物納米囊泡引起腫瘤T2WI信號下降則無統(tǒng)計學(xué)差異;注射負載SPIO聚合物納米囊泡兩組的腫瘤細胞普魯士藍
9、染色顯示細胞漿內(nèi)出現(xiàn)藍色顆粒,電鏡切片觀察可見高密度鐵顆粒位于細胞漿內(nèi);而注射單純SPIO膠體液組電鏡和普魯士藍染色未有陽性發(fā)現(xiàn)。負載油性SPIO、水性SPIO聚合物納米囊泡、單純SPIO膠體液均引起肝臟T2WI信號下降,以注射后1~6h為明顯,三者有統(tǒng)計學(xué)差異(p<0.01),負載水性SPIO聚合物納米囊泡引起的信號下降最明顯,最大值下降約56%,其次為負載油性SPIO聚合物納米囊泡,最后為單純SPIO膠體液。三種對比劑均未引起肌肉組
10、織的T2WI信號下降。
結(jié)論:
⑴負載SPIO聚合物納米囊泡比單純SPIO膠體液表現(xiàn)出更高的MRI敏感性,負載水性SPIO聚合物囊泡的T2馳豫率(1/T2)高于負載油性SPIO聚合物納米囊泡。
⑵在一定濃度范圍內(nèi),負載SPIO聚合物納米囊泡無明顯的細胞毒性。
⑶負載SPIO聚合物納米囊泡標(biāo)記人結(jié)腸癌細胞是完全可能的,其中負載水性SPIO聚合物納米囊泡標(biāo)記細胞后引起的T2馳豫率更高。
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