體外定向誘導(dǎo)小鼠胚胎干細(xì)胞向血管平滑肌細(xì)胞分化.pdf

1、目的：通過選擇適當(dāng)?shù)恼T導(dǎo)劑，探討胚胎干細(xì)胞體外向血管平滑肌細(xì)胞分化的趨勢。觀察胚胎干細(xì)胞在體外不同條件下定向誘導(dǎo)分化血管平滑肌細(xì)胞的能力。 方法：實(shí)驗(yàn)于2006年8月至2007年2月在南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院血液病研究所完成。①動物及細(xì)胞系：清潔級孕12.5天的昆明小白鼠1只，實(shí)驗(yàn)過程中對動物的處置符合動物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)；小鼠胚胎干細(xì)胞系129X/SvJ由美國ATCC提供。②實(shí)驗(yàn)方法：從12.5天的胎鼠中分離出原代胚胎成纖維細(xì)胞，當(dāng)原代

2、胚胎成纖維細(xì)胞傳至3～5代時(shí)，更換為含體積分?jǐn)?shù)為0.15胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基，24小時(shí)后收集培養(yǎng)液，加入條件培養(yǎng)基。用其對小鼠胚胎干細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)，傳代時(shí)用差速貼壁法分離去除已分化的胚胎干細(xì)胞，經(jīng)過懸滴-懸浮培養(yǎng)，構(gòu)建擬胚體分化模型。設(shè)立3組，各組均置于0.1％明膠處理過的T25培養(yǎng)瓶中，每瓶加入50個(gè)擬胚體，均勻分布于培養(yǎng)瓶底，使擬胚體貼壁生長。誘導(dǎo)組7～10天加入10-9mol/L全反式維甲酸和3μg/L轉(zhuǎn)化生長因子B1，

3、10～21天加入20μg/L血小板源性生長因子，血清對照組僅加入去生長因子胎牛血清，全反式維甲酸組加入全反式維甲酸。誘導(dǎo)21天的擬胚體，用胰蛋白酶和膠原酶Ⅱ聯(lián)合消化為單個(gè)細(xì)胞，再加入20μg/L血小板源性生長因子繼續(xù)誘導(dǎo)7大。③實(shí)驗(yàn)評估：應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測誘導(dǎo)細(xì)胞血管平滑肌肌動蛋白、血管平滑肌肌球夤白重鏈基因的表達(dá)，通過免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)檢測血管平滑肌肌動蛋白的表達(dá)來鑒定細(xì)胞性質(zhì)。 結(jié)果：①胚胎干細(xì)胞生長

4、及擬胚體誘導(dǎo)分化：胚胎干細(xì)胞在體外能自發(fā)形成擬胚體，經(jīng)過不同生長因子的分階段聯(lián)合誘導(dǎo)，擬胚體周圍出現(xiàn)大量的梭形細(xì)胞。②RT-PCR檢測：擬胚體血管平滑肌肌動蛋白和血管甲滑肌肌球蛋白重鏈基因均呈陽性表達(dá)。⑧免疫細(xì)胞化學(xué)檢測：熒光顯微鏡下，羅丹明染色細(xì)胞漿呈紅色熒光，并可見肌絲結(jié)構(gòu)；DAPI染色細(xì)胞核呈藍(lán)色熒光。誘導(dǎo)組血管平滑肌肌動蛋白陽性率明顯高于血清對照組和全反式維甲酸組(P<0.01)。 結(jié)論：①在條件培養(yǎng)基無飼養(yǎng)層上可大量擴(kuò)