Brachyury在小鼠胚胎干細(xì)胞分化為心肌細(xì)胞中的作用.pdf

1、小鼠胚胎干細(xì)胞（mESCs）來(lái)源于胚胎著床前的多能干細(xì)胞，能夠在體外持續(xù)培養(yǎng)并保持自我更新的能力，同時(shí)又具有多向分化的潛能，可以分化成機(jī)體的各種細(xì)胞類型。目前己經(jīng)在發(fā)育分化模型的構(gòu)建中起到不可或缺的作用，同時(shí)廣泛的用于再生醫(yī)學(xué)的研究及細(xì)胞學(xué)移植的研究。
　　經(jīng)典的Wnt/β-catenin信號(hào)通路在胚胎的發(fā)育以及多種干細(xì)胞的分化中起著關(guān)鍵的作用。研究表明，Wnt/β-catenin信號(hào)通路在胚胎時(shí)期心臟的發(fā)育以及血管形成等過(guò)程中起

2、到了不可或缺的作用，在胚胎干細(xì)胞分化過(guò)程的特定的時(shí)間段激活該信號(hào)通路可誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞定向分化成心肌細(xì)胞。Brachyury（T）基因是Wnt/β-catenin信號(hào)通路的下游靶基因，也是中胚層的標(biāo)志基因，在胚胎發(fā)育中胚層形成的過(guò)程中高度表達(dá)。
　　為了研究T基因在mESCs分化過(guò)程中的作用，我們通過(guò)PB（PiggyBac）質(zhì)粒過(guò)表達(dá)該基因，將構(gòu)建好過(guò)表達(dá)質(zhì)粒后轉(zhuǎn)染到mESCs中，采用LIF/serum培養(yǎng)基培養(yǎng)，并用細(xì)胞計(jì)數(shù)的方法

3、檢測(cè)過(guò)表達(dá)T基因后細(xì)胞的增殖情況，并用堿性磷酸酶染色（AP染色）方法檢測(cè)mESCs的分化情況。分化實(shí)驗(yàn)是采用單個(gè)細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的方法首先形成擬胚體(EBs)，形成的EBs可形成三個(gè)胚層，其中中胚層可進(jìn)一步分化形成心肌細(xì)胞。研究報(bào)道，單獨(dú)使用GSK3β抑制劑BIO可以誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞分化成心肌細(xì)胞。我們研究表明在mESCs分化早期階段加入GSK3β抑制劑CHIR99021(CHIR)可以促進(jìn)胚胎干細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化，實(shí)驗(yàn)時(shí)我們加入CHIR作為

4、陽(yáng)性對(duì)照組。研究結(jié)果表明，過(guò)表達(dá)T基因后細(xì)胞的增殖慢于對(duì)照組，且細(xì)胞的分化傾向增加且更易于分化。分化實(shí)驗(yàn)的qRT-PCR結(jié)果表明，三組隨著分化時(shí)間的增加心肌標(biāo)志基因cTnT、Cx43、Nkx2.5、和α-MHC的表達(dá)量增加，其中過(guò)表達(dá)T基因的T組表達(dá)量高于陰性對(duì)照PB組，而低于陽(yáng)性對(duì)照CH組。Western blot結(jié)果顯示第10天T組的Cx43和α-MHC蛋白的表達(dá)量高于PB組而低于CH組，第15天的蛋白表達(dá)量趨勢(shì)與第10天一樣，但各

5、組相應(yīng)的蛋白表達(dá)量高于第10天的表達(dá)量。免疫熒光染色結(jié)果與Western blot結(jié)果趨勢(shì)一樣即三組中α-MHC和Cx43蛋白免疫熒光均陽(yáng)性，T組熒光強(qiáng)于PB組，CH組熒光強(qiáng)于T組。因此，過(guò)表達(dá)T基因可促進(jìn)mESCs向心肌細(xì)胞分化，分化效率弱于GSK3β抑制劑CHIR的誘導(dǎo)效率。
　　為了進(jìn)一步研究T基因的促進(jìn)mESCs心肌細(xì)胞的分化作用，我們采用慢病毒pLKO.1質(zhì)粒系統(tǒng)敲低該基因，將重組質(zhì)粒用相同的方法轉(zhuǎn)染到mESCs中，采用

6、LIF/serum培養(yǎng)基培養(yǎng)，用懸浮培養(yǎng)方法形成EBs。用qRT-PCR檢測(cè)心肌標(biāo)志基因的表達(dá)情況，用Western blot檢測(cè)心肌標(biāo)志蛋白。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明三組隨著分化時(shí)間的增加心肌標(biāo)志基因cTnT、Cx43、Nkx2.5和α-MHC的表達(dá)量增加，其中敲低組的表達(dá)量低于對(duì)照組。Western blot結(jié)果顯示第10天敲低組的Cx43和α-MHC蛋白的表達(dá)量低于對(duì)照組，第15天的蛋白表達(dá)量趨勢(shì)與第10天一樣，但各組相應(yīng)的蛋白表達(dá)量高于第1