腎上腺髓質(zhì)素在腎腫瘤血管生成中的作用及干預治療的實驗研究.pdf

1、第一部分、腎上腺髓質(zhì)素在腎腫瘤組織中的表達和其與腫瘤組織微血管密度關系的研究
　　 目的：應用免疫組織化學方法、流式細胞學方法觀察檢測腎細胞癌組織、正常腎組織中腎上腺髓質(zhì)素(Adrenomedullin，ADM)的表達情況，并檢測腎腫瘤組織和正常腎組織微血管密度(Microvessel density，MVD)，旨在探討ADM在腎細胞癌發(fā)生發(fā)展中的作用，及其腎腫瘤血管生成作用，為研究腎細胞癌侵襲轉(zhuǎn)移、預后判斷以及分子生物學分期提

2、供一個分子生物學指標，并為腎細胞癌的綜合治療，尤其是基因靶向治療提供理論依據(jù)。
　　 方法：收集資料完整的腎細胞癌病例33例，標本離體后均在無菌條件下立即取材，每一例標本包括癌組織、距腫瘤邊緣2cm以上正常腎實質(zhì)組織。分別應用免疫組織化學染色和流式細胞學方法檢測腎腫瘤組織和正常腎組織中ADM和腎上腺髓質(zhì)素受體(Adrenomedullin receptor，ADMR)的表達和兩組組織MVD，并分析ADM和ADMR在組織中表達與M

3、VD的相關性。
　　 結(jié)果：免疫組織化學檢測ADM在腎細胞癌組織中表達陽性率為100％，而在正常腎組織中表達陽性率僅9.1％，且表達弱陽性；流式細胞學方法檢測腎細胞癌組織中ADM表達水平為1267.84±127.52，正常腎組織中ADM表達水平為970.36±0171.46，P=0.000＜0.05，ADM在腎細胞癌組織中表達水平明顯高于其在正常腎組織中表達水平。腎細胞癌組織ADMR表達水平1161.91±202.71，正常腎組

4、織ADMR表達水平826.05±171.99，P=0.000＜0.05，ADMR在腎細胞癌組織中表達水平明顯高于其在正常腎組織中表達水平。與組織MVD相關性分析發(fā)現(xiàn)ADM和ADMR在腎細胞癌組織中表達與組織微血管密度呈正相關性。
　　 結(jié)論：ADM和ADMR在腎細胞癌組織中表達明顯高于其在正常腎組織中表達，并且ADM和ADMR在腎細胞癌組織中高表達與腫瘤組織MVD呈正相關性，表明ADM在腎腫瘤新生血管生成方面起到一定促進作用，A

5、DM可能成為腎腫瘤靶向治療新的靶點。
　　 第二部分、低氧刺激誘導ADM在腎腫瘤細胞的表達及ADM對VEGF在腎腫瘤細胞表達的影響
　　 目的：探討低氧刺激誘導ADM在腎腫瘤細胞中表達的影響，并研究ADM對VEGF在腎腫瘤細胞中表達的影響，進一步探討ADM在腎腫瘤新生血管生成方面的作用。
　　 方法：在低氧分壓(5％ CO2，94.55％ N2，0.45％ O2，37C0)狀態(tài)和正常氧分壓(20％ O25％ CO

6、2，37C0)狀態(tài)下培養(yǎng)人腎腫瘤細胞786-o，Western blot和RT-PCR檢測ADM在腎腫瘤細胞中表達；在正常氧分壓狀態(tài)下培養(yǎng)人腎腫瘤細胞786-o，分別加入外源性ADM和ADM+ADM受體抑制劑，Western boltting和RT-PCR檢測VEGF在腎腫瘤細胞中表達。
　　 結(jié)果：
　　 1.低氧刺激可誘導ADM在腎腫瘤細胞中表達升高。
　　 低氧培養(yǎng)腎腫瘤細胞3小時，western blot

7、檢測ADM在腎腫瘤細胞中表達明顯高于對照組，t=-8.603 p=0.000＜0.05;RT-PCR檢測ADM mRNA在腎腫瘤細胞中表達明顯高于對照組，t=-13.277P=0.000＜0.05;并且隨低氧刺激時間延長，ADM和ADMmRNA在腎腫瘤細胞中表達將進一步升高。
　　 2.ADM對VEGF在腎腫瘤細胞中表達的影響。
　　 Western blot檢測VEGF在ADM處理組腎腫瘤細胞中表達明顯高于其在對照組的

8、表達（24h組 t=-3.069 P=0.007＜0.05;48h組 t=-18.692 P=0.000＜0.05；72h組 t=-35.184 P=0.000＜0.05）；VEGF在ADM+ADM受體抑制劑組腎腫瘤細胞中表達與其在對照組表達無區(qū)別（24h組 t=0.922 P=0.369＞0.05;48h組 t=0.043 P=0.966＞0.05；72h組 t=-0.372 P=0.714＞0.05)。
　　 RT-PCR檢

9、測VEGF mRNA在腎腫瘤細胞中表達，結(jié)果顯示VEGF mRNA在ADM處理組腎腫瘤細胞中表達高于其在對照組的表達（24h組 t=-2.910 P=0.009＜0.05;48h組 t=-19.006 P=0.000＜0.05;72h組 t=-30.973 P=0.000＜0.05）；VEGFmRNA在ADM+ADM受體抑制劑組腎腫瘤細胞中表達與其在對照組的表達無區(qū)別（24h組 t=-0.597 P=0.558＞0.05；48h組 t=

10、0.605 P=0.553＞0.05;72h組 t=-0.620 P=0.543＞0.05)。
　　 結(jié)論：低氧刺激可誘導ADM在人腎腫瘤細胞中表達升高，并且隨低氧刺激時間的延長ADM的表達將進一步升高。ADM可誘導VEGF在腎腫瘤細胞中表達升高。ADM受體抑制劑可有效阻斷ADM誘導VEGF在腎腫瘤細胞中表達升高的作用。ADM可能通過誘導VEGF表達升高，參與腎腫瘤新生血管生成的調(diào)節(jié)作用。
　　 第三部分、ADM在腎腫瘤

11、血管生成信號轉(zhuǎn)導通路的研究
　　 目的：磷脂酰肌醇-3激酶(Phosphatidylinositol-3 kinase，PI3K)/蛋白激酶B(Protein kinase B，Akt or PKB)通路具有調(diào)節(jié)細胞生長，增殖，血管生成和提高細胞耐受低氧或營養(yǎng)缺乏的作用。本部分通過研究ADM對腎腫瘤細胞內(nèi)PI3K/Akt通路的激活作用和對內(nèi)皮一氧化氮合酶(Nitricoxide synthase，eNOS)表達的影響，進一步探討

12、ADM對腎腫瘤血管生成及腫瘤進展方面的作用。
　　 方法：將人腎腫瘤786-o細胞分為對照組，ADM刺激組，VEGF刺激組，ADM+VEGF受體抑制劑刺激組，ADM+ADM受體抑制劑刺激組，每組又設24小時，48小時，72小時三個時間組。westen-blot檢測各組細胞總蛋白中PI3K、Akt、eNOS的表達水平。
　　 結(jié)果：ADM處理組、VEGF處理組、ADM+VEGF受體抑制劑處理組與對照組相比PI3K/Akt和

13、eNOS表達均高與對照組（PI3K表達：ADM組：對照組 t=-7.555 P=0.000＜0.05；VEGF組：對照組 t=-3.03 P=0.007＜0.05；ADM+VEGF受體抑制劑組：對照組 t=-3.832 P=0.001＜0.05;Akt表達：ADM組：對照組 t=-3.339 P=0.004＜0.05;VEGF組：對照組 t=-3.805 P=0.001＜0.05;ADM+VEGF受體抑制劑組：對照組 t=-3.519

14、P=0.003＜0.05;eNOS表達：ADM組：對照組t=-13.443 P=0.000＜0.05;VEGF組：對照組t=-12.607 P=0.007＜0.05;ADM+VEGF受體抑制劑組：對照組 t=-13.088 P=0.001＜0.05），具有統(tǒng)計學意義，并且隨作用時間延長，PI3K/Akt和eNOS表達將進一步升高。但ADM處理組和ADM+VEGF受體抑制劑處理組相比，PI3K/Akt和eNOS在細胞內(nèi)表達無區(qū)別（PI3K

15、表達 ADM組：ADM+VEGF受體抑制劑組24h組 t=0.726，P=0.477＞0.05;48h組 t=0.199，P=0.844＞0.05;72h組 t=0.171，P=0.866＞0.05。Akt表達ADM組：ADM+VEGF受體抑制劑組24h組 t=0.501 P=0.624＞0.05;48h組 t=1.03 P=0.317＞0.05;72h組 t=0.946 P=0.357＞0.05。eNOS表達ADM組：ADM+VEGF

16、受體抑制劑組24h組t=-0.017 P=0.987＞0.05;48h組 t=0.430 P=0.672＞0.05;72h組 t=-0.370 P=0.715＞0.05)。
　　 ADM組PI3K/Akt和eNOS在細胞內(nèi)表達明顯高于加入ADM受體抑制劑組(PI3K表達 ADM組：ADM+ADM受體抑制劑組24h組 t=3.456 P=0.003＜0.05;48h組 t=6.960 P=0.000＜0.05;72h組 t=10.

17、397 P=0.000＜0.05。Akt表達 ADM組：ADM+ADM受體抑制劑組24h組 t=2.629 P=0.017＜0.05;48h組 t=7.286 P=0.000＜0.05;72h組 t=11.166 P=0.000＜0.05。eNOS表達 ADM組：ADM+ADM受體抑制劑組24h組 t=4.685 P=0.000＜0.05;48h組 t=6.960 P=0.000＜0.05;72h組 t=19.297 P=0.000＜0

18、.05），均具有統(tǒng)計學意義。而ADM+ADM受體抑制劑組PI3K/Akt和eNOS在細胞內(nèi)表達與對照組無區(qū)別(PI3K表達ADM+ADM受體抑制劑組：對照組24h組 t=1.011 P=0.325＞0.05;48h組 t=-0.335 P=0.741＞0.05;72h組 t=0.031 P=0.975＞0.05。Akt表達 ADM+ADM受體抑制劑組：對照組24h組 t=-0.353 P=0.728＞0.05；48h組 t=-0.44

19、P=0.665＞0.05;72h組 t=-0.139 P=0.891＞0.05。eNOS表達ADM+ADM受體抑制劑組：對照組24h組 t=-0.582 P=0.568＞0.05;48h組 t=-0.651 P=0.741＞0.05;72h組 t=-0.528 P=0.523＞0.05），無統(tǒng)計學意義。
　　 結(jié)論：ADM和VEGF均可激活腎腫瘤細胞PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導通路并誘導eNOS在腫瘤細胞中表達升高。VEGF受體抑制