腎上腺髓質(zhì)素在腎腫瘤血管生成中的作用及干預(yù)治療的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、第一部分、腎上腺髓質(zhì)素在腎腫瘤組織中的表達(dá)和其與腫瘤組織微血管密度關(guān)系的研究
　　 目的：應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法、流式細(xì)胞學(xué)方法觀察檢測腎細(xì)胞癌組織、正常腎組織中腎上腺髓質(zhì)素(Adrenomedullin，ADM)的表達(dá)情況，并檢測腎腫瘤組織和正常腎組織微血管密度(Microvessel density，MVD)，旨在探討ADM在腎細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展中的作用，及其腎腫瘤血管生成作用，為研究腎細(xì)胞癌侵襲轉(zhuǎn)移、預(yù)后判斷以及分子生物學(xué)分期提

2、供一個(gè)分子生物學(xué)指標(biāo)，并為腎細(xì)胞癌的綜合治療，尤其是基因靶向治療提供理論依據(jù)。
　　 方法：收集資料完整的腎細(xì)胞癌病例33例，標(biāo)本離體后均在無菌條件下立即取材，每一例標(biāo)本包括癌組織、距腫瘤邊緣2cm以上正常腎實(shí)質(zhì)組織。分別應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色和流式細(xì)胞學(xué)方法檢測腎腫瘤組織和正常腎組織中ADM和腎上腺髓質(zhì)素受體(Adrenomedullin receptor，ADMR)的表達(dá)和兩組組織MVD，并分析ADM和ADMR在組織中表達(dá)與M

3、VD的相關(guān)性。
　　 結(jié)果：免疫組織化學(xué)檢測ADM在腎細(xì)胞癌組織中表達(dá)陽性率為100％，而在正常腎組織中表達(dá)陽性率僅9.1％，且表達(dá)弱陽性；流式細(xì)胞學(xué)方法檢測腎細(xì)胞癌組織中ADM表達(dá)水平為1267.84±127.52，正常腎組織中ADM表達(dá)水平為970.36±0171.46，P=0.000＜0.05，ADM在腎細(xì)胞癌組織中表達(dá)水平明顯高于其在正常腎組織中表達(dá)水平。腎細(xì)胞癌組織ADMR表達(dá)水平1161.91±202.71，正常腎組

4、織ADMR表達(dá)水平826.05±171.99，P=0.000＜0.05，ADMR在腎細(xì)胞癌組織中表達(dá)水平明顯高于其在正常腎組織中表達(dá)水平。與組織MVD相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)ADM和ADMR在腎細(xì)胞癌組織中表達(dá)與組織微血管密度呈正相關(guān)性。
　　 結(jié)論：ADM和ADMR在腎細(xì)胞癌組織中表達(dá)明顯高于其在正常腎組織中表達(dá)，并且ADM和ADMR在腎細(xì)胞癌組織中高表達(dá)與腫瘤組織MVD呈正相關(guān)性，表明ADM在腎腫瘤新生血管生成方面起到一定促進(jìn)作用，A

5、DM可能成為腎腫瘤靶向治療新的靶點(diǎn)。
　　 第二部分、低氧刺激誘導(dǎo)ADM在腎腫瘤細(xì)胞的表達(dá)及ADM對VEGF在腎腫瘤細(xì)胞表達(dá)的影響
　　 目的：探討低氧刺激誘導(dǎo)ADM在腎腫瘤細(xì)胞中表達(dá)的影響，并研究ADM對VEGF在腎腫瘤細(xì)胞中表達(dá)的影響，進(jìn)一步探討ADM在腎腫瘤新生血管生成方面的作用。
　　 方法：在低氧分壓(5％ CO2，94.55％ N2，0.45％ O2，37C0)狀態(tài)和正常氧分壓(20％ O25％ CO

6、2，37C0)狀態(tài)下培養(yǎng)人腎腫瘤細(xì)胞786-o，Western blot和RT-PCR檢測ADM在腎腫瘤細(xì)胞中表達(dá)；在正常氧分壓狀態(tài)下培養(yǎng)人腎腫瘤細(xì)胞786-o，分別加入外源性ADM和ADM+ADM受體抑制劑，Western boltting和RT-PCR檢測VEGF在腎腫瘤細(xì)胞中表達(dá)。
　　 結(jié)果：
　　 1.低氧刺激可誘導(dǎo)ADM在腎腫瘤細(xì)胞中表達(dá)升高。
　　 低氧培養(yǎng)腎腫瘤細(xì)胞3小時(shí)，western blot

7、檢測ADM在腎腫瘤細(xì)胞中表達(dá)明顯高于對照組，t=-8.603 p=0.000＜0.05;RT-PCR檢測ADM mRNA在腎腫瘤細(xì)胞中表達(dá)明顯高于對照組，t=-13.277P=0.000＜0.05;并且隨低氧刺激時(shí)間延長，ADM和ADMmRNA在腎腫瘤細(xì)胞中表達(dá)將進(jìn)一步升高。
　　 2.ADM對VEGF在腎腫瘤細(xì)胞中表達(dá)的影響。
　　 Western blot檢測VEGF在ADM處理組腎腫瘤細(xì)胞中表達(dá)明顯高于其在對照組的

8、表達(dá)（24h組 t=-3.069 P=0.007＜0.05;48h組 t=-18.692 P=0.000＜0.05；72h組 t=-35.184 P=0.000＜0.05）；VEGF在ADM+ADM受體抑制劑組腎腫瘤細(xì)胞中表達(dá)與其在對照組表達(dá)無區(qū)別（24h組 t=0.922 P=0.369＞0.05;48h組 t=0.043 P=0.966＞0.05；72h組 t=-0.372 P=0.714＞0.05)。
　　 RT-PCR檢

9、測VEGF mRNA在腎腫瘤細(xì)胞中表達(dá)，結(jié)果顯示VEGF mRNA在ADM處理組腎腫瘤細(xì)胞中表達(dá)高于其在對照組的表達(dá)（24h組 t=-2.910 P=0.009＜0.05;48h組 t=-19.006 P=0.000＜0.05;72h組 t=-30.973 P=0.000＜0.05）；VEGFmRNA在ADM+ADM受體抑制劑組腎腫瘤細(xì)胞中表達(dá)與其在對照組的表達(dá)無區(qū)別（24h組 t=-0.597 P=0.558＞0.05；48h組 t=

10、0.605 P=0.553＞0.05;72h組 t=-0.620 P=0.543＞0.05)。
　　 結(jié)論：低氧刺激可誘導(dǎo)ADM在人腎腫瘤細(xì)胞中表達(dá)升高，并且隨低氧刺激時(shí)間的延長ADM的表達(dá)將進(jìn)一步升高。ADM可誘導(dǎo)VEGF在腎腫瘤細(xì)胞中表達(dá)升高。ADM受體抑制劑可有效阻斷ADM誘導(dǎo)VEGF在腎腫瘤細(xì)胞中表達(dá)升高的作用。ADM可能通過誘導(dǎo)VEGF表達(dá)升高，參與腎腫瘤新生血管生成的調(diào)節(jié)作用。
　　 第三部分、ADM在腎腫瘤

11、血管生成信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的研究
　　 目的：磷脂酰肌醇-3激酶(Phosphatidylinositol-3 kinase，PI3K)/蛋白激酶B(Protein kinase B，Akt or PKB)通路具有調(diào)節(jié)細(xì)胞生長，增殖，血管生成和提高細(xì)胞耐受低氧或營養(yǎng)缺乏的作用。本部分通過研究ADM對腎腫瘤細(xì)胞內(nèi)PI3K/Akt通路的激活作用和對內(nèi)皮一氧化氮合酶(Nitricoxide synthase，eNOS)表達(dá)的影響，進(jìn)一步探討

12、ADM對腎腫瘤血管生成及腫瘤進(jìn)展方面的作用。
　　 方法：將人腎腫瘤786-o細(xì)胞分為對照組，ADM刺激組，VEGF刺激組，ADM+VEGF受體抑制劑刺激組，ADM+ADM受體抑制劑刺激組，每組又設(shè)24小時(shí)，48小時(shí)，72小時(shí)三個(gè)時(shí)間組。westen-blot檢測各組細(xì)胞總蛋白中PI3K、Akt、eNOS的表達(dá)水平。
　　 結(jié)果：ADM處理組、VEGF處理組、ADM+VEGF受體抑制劑處理組與對照組相比PI3K/Akt和

13、eNOS表達(dá)均高與對照組（PI3K表達(dá)：ADM組：對照組 t=-7.555 P=0.000＜0.05；VEGF組：對照組 t=-3.03 P=0.007＜0.05；ADM+VEGF受體抑制劑組：對照組 t=-3.832 P=0.001＜0.05;Akt表達(dá)：ADM組：對照組 t=-3.339 P=0.004＜0.05;VEGF組：對照組 t=-3.805 P=0.001＜0.05;ADM+VEGF受體抑制劑組：對照組 t=-3.519

14、P=0.003＜0.05;eNOS表達(dá)：ADM組：對照組t=-13.443 P=0.000＜0.05;VEGF組：對照組t=-12.607 P=0.007＜0.05;ADM+VEGF受體抑制劑組：對照組 t=-13.088 P=0.001＜0.05），具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，并且隨作用時(shí)間延長，PI3K/Akt和eNOS表達(dá)將進(jìn)一步升高。但ADM處理組和ADM+VEGF受體抑制劑處理組相比，PI3K/Akt和eNOS在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)無區(qū)別（PI3K

15、表達(dá) ADM組：ADM+VEGF受體抑制劑組24h組 t=0.726，P=0.477＞0.05;48h組 t=0.199，P=0.844＞0.05;72h組 t=0.171，P=0.866＞0.05。Akt表達(dá)ADM組：ADM+VEGF受體抑制劑組24h組 t=0.501 P=0.624＞0.05;48h組 t=1.03 P=0.317＞0.05;72h組 t=0.946 P=0.357＞0.05。eNOS表達(dá)ADM組：ADM+VEGF

16、受體抑制劑組24h組t=-0.017 P=0.987＞0.05;48h組 t=0.430 P=0.672＞0.05;72h組 t=-0.370 P=0.715＞0.05)。
　　 ADM組PI3K/Akt和eNOS在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)明顯高于加入ADM受體抑制劑組(PI3K表達(dá) ADM組：ADM+ADM受體抑制劑組24h組 t=3.456 P=0.003＜0.05;48h組 t=6.960 P=0.000＜0.05;72h組 t=10.

17、397 P=0.000＜0.05。Akt表達(dá) ADM組：ADM+ADM受體抑制劑組24h組 t=2.629 P=0.017＜0.05;48h組 t=7.286 P=0.000＜0.05;72h組 t=11.166 P=0.000＜0.05。eNOS表達(dá) ADM組：ADM+ADM受體抑制劑組24h組 t=4.685 P=0.000＜0.05;48h組 t=6.960 P=0.000＜0.05;72h組 t=19.297 P=0.000＜0

18、.05），均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而ADM+ADM受體抑制劑組PI3K/Akt和eNOS在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)與對照組無區(qū)別(PI3K表達(dá)ADM+ADM受體抑制劑組：對照組24h組 t=1.011 P=0.325＞0.05;48h組 t=-0.335 P=0.741＞0.05;72h組 t=0.031 P=0.975＞0.05。Akt表達(dá) ADM+ADM受體抑制劑組：對照組24h組 t=-0.353 P=0.728＞0.05；48h組 t=-0.44

19、P=0.665＞0.05;72h組 t=-0.139 P=0.891＞0.05。eNOS表達(dá)ADM+ADM受體抑制劑組：對照組24h組 t=-0.582 P=0.568＞0.05;48h組 t=-0.651 P=0.741＞0.05;72h組 t=-0.528 P=0.523＞0.05），無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)論：ADM和VEGF均可激活腎腫瘤細(xì)胞PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路并誘導(dǎo)eNOS在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)升高。VEGF受體抑制