重組腎上腺髓質素真核表達載體的構建及實驗研究.pdf

1、腎上腺髓質素(adrenomedullin, ADM)是Kitamura等人于1993年從手術切除的人腎上腺嗜鉻細胞瘤(phaeochromocytoma, PC)組織提取物中發(fā)現(xiàn)的一種生物活性肽.在體內(nèi),它廣泛分布于全身各系統(tǒng)中,具有舒張阻力血管,降低血壓,改善心臟收縮功能,利尿利鈉,增加腎臟血流灌注的作用.ADM被認為是在臨床治療高血壓、慢性心功能衰竭等多種心血管疾病中具有巨大潛在應用價值的一種內(nèi)源性多肽,因此,ADM基因也成為基因

2、治療慢性心功能不全的重要候選基因.同時,也由于腎上腺髓質素的臨床應用受其半衰期短(僅22min)的限制,隨著分子生物學技術的發(fā)展,探索體內(nèi)表達ADM的方法,成為發(fā)揮ADM治療作用的一條有價值的途徑.該課題分為六部分.1.構建重組ADM真核表達載體,并在無內(nèi)源性ADM表達的K<,562>細胞株上進行了體外表達實驗.2.實驗中用pcDNA3.1ADM處理體外培養(yǎng)的心肌細胞并用BCA方法檢測總蛋白含量,結果顯示,10<'-7>mol/L的AN

3、GⅡ處理心肌細胞72hr能誘導心肌細胞總蛋白含量增加,而在開始用ANGⅡ處理細胞時即轉染pcDNA3.1ADM的一組72hr后ANGⅡ誘導的心肌細胞蛋白合成增多得到部分抑制.3.實驗中用結扎大鼠冠狀動脈前降支的方法構建了慢性心功能減退的實驗動物模型,并采用心動超聲和導管法評價心臟功能.4.實驗中用PCR方法檢測靜脈注射pcDNA3.1ADM后其在大鼠體內(nèi)的分布.結果在心、肺、腎、腦、肝、脾等臟器中擴增到pcDNA3.1的部分特異序列.進

4、一步用原位雜交的方法進行檢測.5.用放射免疫分析方法檢測大鼠血漿中ADM的含量,結扎冠狀動脈5周后的大鼠,血漿ADM含量較假手術組血漿ADM含量有顯著增高.6.上述pcDNA3.1ADM載體表達的是腎上腺髓質素前肽原翻譯區(qū).綜上所述,我們在實驗中構建了重組ADM真核表達載體pcDNA3.1ADM,并證實構建的重組pcDNA3.1ADM載體能夠在哺乳類細胞中表達ADM.用pcDNA3.1ADM轉染心肌細胞后,能抑制ANGⅡ誘導的蛋白合成增

5、多.在慢性心功能減退的大鼠中,靜脈給予100μg pcDNA3.1ADM后,CVP、LVEDP降低,EF、-dp/dt<,max>升高,尿排出量增加,顯示可以在不降低平均動脈壓的情況下產(chǎn)生利尿作用,并顯示一定的改善心室舒張功能的作用.pcDNA3.1ADM在體內(nèi)多處廣泛分布,其中在肺臟、腎臟組織分布最為密集.給予外源性pcDNA3.1ADM后,血漿中和肺組織ADM含量有升高趨勢,而心臟中ADM含量顯示下降趨勢,可能是外源性表達增加和內(nèi)源