初級(jí)感覺(jué)神經(jīng)元?jiǎng)幼麟娢粫r(shí)空可塑性的離子通道機(jī)制——病理痛信號(hào)的空間編碼-.pdf

1、神經(jīng)系統(tǒng)可以對(duì)來(lái)自?xún)?nèi)、外環(huán)境的信息進(jìn)行轉(zhuǎn)化、編碼、整合、儲(chǔ)存和傳遞，這些過(guò)程主要是通過(guò)“全或無(wú)”的動(dòng)作電位以規(guī)則或不規(guī)則放電的形式在神經(jīng)纖維上的傳導(dǎo)和突觸之間的傳遞實(shí)現(xiàn)的。通常將動(dòng)作電位大小不隨刺激強(qiáng)度和傳導(dǎo)距離而發(fā)生改變現(xiàn)象稱(chēng)作“全或無(wú)”，這一特性可以保證信息的精確性。目前，對(duì)動(dòng)作電位串編碼的方式雖然有多種學(xué)說(shuō)，例如平均頻率編碼(meanrate code)、群體編碼(population code)、時(shí)間編碼(temporal co

2、de)、模式編碼(pattern code)等等，但是關(guān)于動(dòng)作電位串的模式與神經(jīng)信息的確切關(guān)系問(wèn)題一直存在著爭(zhēng)論。最近的研究表明：大腦皮層神經(jīng)元活動(dòng)模式可能不是利用精確的活動(dòng)模式來(lái)進(jìn)行信息編碼的。這對(duì)當(dāng)前關(guān)于神經(jīng)元節(jié)律編碼信息的觀點(diǎn)產(chǎn)生了極大的影響。是否存在節(jié)律編碼以外的信息傳遞方式呢？對(duì)此，我們知之甚少。
　　傷害性信息通常被認(rèn)為是在初級(jí)感覺(jué)神經(jīng)元和終末的傷害性感受器激活后形成的動(dòng)作電位串，可以將危害機(jī)體的刺激信息(模式、強(qiáng)度、

3、時(shí)程）進(jìn)行初級(jí)編碼，然后以一定時(shí)間序列沿著軀體感覺(jué)神經(jīng)纖維的中樞突向脊髓傳遞。與經(jīng)典的動(dòng)作電位不同，由于離子通道的多樣性和多態(tài)性、特異性的離子通道阻斷劑的缺乏以及離子通道活性調(diào)節(jié)的多因素性，傷害性感受器動(dòng)作電位產(chǎn)生機(jī)制以及在病理性痛中的作用不甚清晰。更為重要的是，由于長(zhǎng)期受到“全或無(wú)”動(dòng)作電位編碼信息理論的影響，目前對(duì)于病理過(guò)程中的單個(gè)動(dòng)作電位時(shí)空參數(shù)(尤其是幅度和去極化時(shí)程)是否發(fā)生改變及其功能意義研究甚少。
　　本課題主要運(yùn)用

4、膜片鉗技術(shù)，通過(guò)記錄和分析痛覺(jué)信息傳遞的第一級(jí)神經(jīng)元（DRG神經(jīng)元）動(dòng)作電位的空間參數(shù)（幅度）和時(shí)間參數(shù)（去極化時(shí)程和復(fù)極化時(shí)程），從離體細(xì)胞水平和在體水平兩個(gè)層次上，分別研究神經(jīng)元周?chē)}離子的穩(wěn)態(tài)失衡和炎性病理性痛狀態(tài)下，DRG神經(jīng)元?jiǎng)幼麟娢粫r(shí)空參數(shù)的變化特征。為了探討動(dòng)作電位產(chǎn)生與可塑性的離子通道機(jī)理，我們進(jìn)一步研究了兩種TTX-R鈉通道（NaV1.8和NaV1.9）在動(dòng)作電位時(shí)空可塑性中的作用及功能意義。通過(guò)對(duì)神經(jīng)元單個(gè)動(dòng)作電位時(shí)

5、空參數(shù)的研究，我們得到以下結(jié)果：
　　1.初級(jí)感覺(jué)神經(jīng)元?jiǎng)幼麟娢徊粌H具有時(shí)間可塑性，還有空間可塑性
　　在沒(méi)有外在刺激因素的狀態(tài)下，自發(fā)放電的背根節(jié)（DRG）神經(jīng)元所產(chǎn)生動(dòng)作電位具有“全或無(wú)”的特征，其時(shí)間參數(shù)和空間參數(shù)相同。向DRG神經(jīng)元內(nèi)連續(xù)10次注入相同的電流（強(qiáng)度300pA，間期：3ms，間隔200ms），所產(chǎn)生的動(dòng)作電位具有“全或無(wú)”的特征，而向同一神經(jīng)元內(nèi)連續(xù)10次注入不同強(qiáng)度的電刺激（強(qiáng)度50-500pA，50

6、pA遞增），所產(chǎn)生的動(dòng)作電位波形完全不同。為了進(jìn)一步研究電刺激誘發(fā)動(dòng)作電位的特性，我們采用了以下的電刺激參數(shù)：強(qiáng)度50-500pA，每次遞增50pA，共10串電刺激，每串電刺激的波寬0.5-5ms，每次遞增0.5ms，每個(gè)電刺激時(shí)間間隔200ms，電刺激總計(jì)數(shù)100個(gè)。結(jié)果顯示出以下特點(diǎn)：第一，動(dòng)作電位的幅度在一定時(shí)間參數(shù)上不隨電刺激波寬的增加而改變，但隨電刺激強(qiáng)度的增加而增強(qiáng)。第二，動(dòng)作電位的時(shí)程在同一閾上刺激強(qiáng)度時(shí)隨電刺激波寬的增加

7、而先縮短后恢復(fù)，但在同一波寬卻隨電刺激強(qiáng)度的增加而縮短。第三,動(dòng)作電位的去極化時(shí)程在同一閾上刺激強(qiáng)度時(shí)不隨電刺激波寬的增加而改變，但隨電刺激強(qiáng)度的增加而縮短。第四,動(dòng)作電位的復(fù)極化時(shí)程在同一閾上刺激強(qiáng)度時(shí)隨電刺激波寬的增加而先縮短后恢復(fù)，但在同一波寬卻隨電刺激強(qiáng)度的增加而縮短。這些結(jié)果說(shuō)明：初級(jí)感覺(jué)神經(jīng)元?jiǎng)幼麟娢痪哂袝r(shí)空可塑性。這種可塑性與電刺激參數(shù)有關(guān)，刺激電流的強(qiáng)度主要影響動(dòng)作電位的幅度和去極化時(shí)程，而刺激電流波寬主要影響復(fù)極化時(shí)程

8、。
　　2.細(xì)胞內(nèi)外鈣離子穩(wěn)態(tài)的維持有利于初級(jí)感覺(jué)神經(jīng)元?jiǎng)幼麟娢槐３帧驘o(wú)’的時(shí)空特征
　　1）細(xì)胞外鈣離子濃度改變對(duì)DRG神經(jīng)元?jiǎng)幼麟娢坏挠绊?。形成全?xì)胞模式后，依次將細(xì)胞外的鈣離子調(diào)整為（mM）：2.5Ca，0Ca，1Ca，5Ca和10Ca，分別記錄電刺激（參數(shù)：強(qiáng)度500pA，波寬3ms）誘發(fā)的動(dòng)作電位。其中0Ca條件對(duì)動(dòng)作電位的波形影響最大，可以使DRG神經(jīng)元?jiǎng)幼麟娢坏姆让黠@降低，復(fù)極化時(shí)程顯著延長(zhǎng)，而對(duì)去極化時(shí)

9、程沒(méi)有明顯影響。由于細(xì)胞外0Ca時(shí)，DRG神經(jīng)元靜息膜電位向去極化方向移動(dòng)約10mV，所以0Ca條件對(duì)動(dòng)作電位時(shí)空參數(shù)的影響可能是通過(guò)對(duì)膜電位的影響而實(shí)現(xiàn)的。在5Ca和10Ca條件下，除去極化時(shí)程顯著延長(zhǎng)外，其他參數(shù)沒(méi)有顯著變化。
　　2）細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度降低對(duì)DRG神經(jīng)元?jiǎng)幼麟娢坏挠绊?。?Ca外液和thapsigargin(Tg，1μM)共同孵育神經(jīng)元15min后，排空細(xì)胞內(nèi)鈣離子，記錄電刺激（參數(shù)：強(qiáng)度500pA，波寬3ms

10、）誘發(fā)的動(dòng)作電位。結(jié)果顯示：細(xì)胞內(nèi)鈣離子降低后，可以使DRG神經(jīng)元產(chǎn)生的動(dòng)作電位的幅度降低，總時(shí)程和復(fù)極化時(shí)程顯著延長(zhǎng)，而去極化時(shí)程沒(méi)有明顯改變。
　　3）細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度升高對(duì)DRG神經(jīng)元?jiǎng)幼麟娢粫r(shí)空參數(shù)的影響
　　首先，運(yùn)用鈣離子成像和膜片鉗同步記錄技術(shù)，確定辣椒素（capsaicin）誘發(fā)的鈣離子升高持續(xù)時(shí)間、反應(yīng)幅度以及神經(jīng)元膜電位和內(nèi)向電流變化時(shí)程等參數(shù)。Capsaicin(0.5μM,10s)誘發(fā)的鈣離子濃度增加

11、的峰值出現(xiàn)在給藥后10s，神經(jīng)元內(nèi)鈣離子升高反應(yīng)可以持續(xù)120s以上，而內(nèi)向電流和膜電位在30s時(shí)，已經(jīng)基本恢復(fù)到初始水平。IP3受體阻斷劑2-APB（50μM）不能阻斷capsaicin誘發(fā)的反應(yīng)，而ryanodine受體阻斷劑釕紅（RutheniumRed，RR）10μM可以完全阻斷capsaicin誘發(fā)的鈣離子升高反應(yīng)，對(duì)內(nèi)向電流也有顯著的抑制作用。繼而，我們分別記錄capsaicin之前和停藥30s后，電刺（參數(shù)：強(qiáng)度500pA

12、，波寬3ms）激誘發(fā)的動(dòng)作電位，結(jié)果顯示：細(xì)胞內(nèi)鈣離子升高可以使動(dòng)作電位的幅度顯著降低，而對(duì)去極化時(shí)程和復(fù)極化時(shí)程均沒(méi)有影響。
　　3.外周炎癥條件刺激可以改變初級(jí)感覺(jué)神經(jīng)元?jiǎng)幼麟娢坏臅r(shí)空特性
　　前面的研究已經(jīng)表明：細(xì)胞水平的鈣離子穩(wěn)態(tài)失衡可以引起動(dòng)作電位的可塑性變化。那么在個(gè)體處于病理狀態(tài)下，動(dòng)作電位是否會(huì)發(fā)生變化？其意義如何呢？我們進(jìn)一步運(yùn)用炎性病理性痛模型，研究病理?xiàng)l件下動(dòng)作電位的時(shí)空特性。
　　1）行為學(xué)試驗(yàn)

13、表明，大鼠足底注射CFA（100μl，溶于生理鹽水）1天或蜜蜂毒肽melittin（100μg/100μl，溶于生理鹽水）2h后，熱刺激縮足反應(yīng)潛伏期（PWTL）和機(jī)械刺激閾值（PWMT）均顯著降低。在體電生理記錄表明，CFA或melittin致炎處理后，傷害性熱刺激（49℃水浴）以及毛刷（brush）、觸壓（pressure）和鉗夾（pinch）等機(jī)械刺激誘發(fā)的脊髓背角廣動(dòng)力域（WDR）神經(jīng)元放電反應(yīng)均顯著增強(qiáng)。這些結(jié)果說(shuō)明，CFA和

14、melittin足底注射可以誘發(fā)炎性痛反應(yīng)。
　　2）CFA和melittin致炎處理對(duì)DRG神經(jīng)元興奮性的影響。通過(guò)足底注射熒光指示劑DiI（1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate，17mg/ml，溶于10％DMSO），我們可以鑒定出支配大鼠后肢足底的兩類(lèi)DRG神經(jīng)元（即phasic神經(jīng)元和tonic神經(jīng)元）。結(jié)果顯示：CFA和meli

15、ttin致炎處理對(duì)兩類(lèi)DRG神經(jīng)元興奮性的影響不同，tonic神經(jīng)元可以通過(guò)降低動(dòng)作電位閾值和增加放電個(gè)數(shù)而提高神經(jīng)元的興奮性，而phasic神經(jīng)元的興奮性并未發(fā)生顯著改變。結(jié)果提示：在炎性病理性痛狀態(tài)下，傷害性信息可能同時(shí)以節(jié)律編碼和非節(jié)律編碼的方式進(jìn)行傳遞。
　　3）CFA和melittin致炎處理對(duì)兩類(lèi)DRG神經(jīng)元?jiǎng)幼麟娢粫r(shí)空參數(shù)的影響。通過(guò)比較CFA或melittin致炎處理前后，相同的電流刺激（強(qiáng)度50-500pA，波寬

16、3ms，時(shí)間間隔200ms）誘發(fā)動(dòng)作電位的波形，結(jié)果顯示：tonic神經(jīng)元的波形發(fā)生顯著性改變，電刺激下動(dòng)作電位的幅度和超射值顯著增加，去極化時(shí)程和復(fù)極化時(shí)程均顯著縮短。而phasic神經(jīng)元?jiǎng)幼麟娢徊ㄐ蔚母淖兩杂胁煌篊FA致炎處理后phasic神經(jīng)元?jiǎng)幼麟娢坏姆群统渲碉@著增加，去極化時(shí)程和復(fù)極化時(shí)程均顯著縮短，而melittin致炎處理后，phasic神經(jīng)元?jiǎng)幼麟娢坏姆群统渲碉@著增加，復(fù)極化時(shí)程顯著縮短，但去極化時(shí)程沒(méi)有明顯變

17、化。結(jié)果提示：除了上述神經(jīng)元興奮性改變以外，在炎性病理性痛狀態(tài)下，DRG神經(jīng)元?jiǎng)幼麟娢坏牟ㄐ我部梢园l(fā)生顯著變化，而這種改變可能是一種新的神經(jīng)元可塑性的表現(xiàn)。
　　4）炎性病理性痛條件下,動(dòng)作電位時(shí)空可塑性變化可能與TTX-R鈉通道相關(guān)。在正常狀態(tài)下，給予相同的電流刺激（強(qiáng)度50-500pA，50pA遞增，波寬3ms，時(shí)間間隔200ms）誘發(fā)動(dòng)作電位，TTX（1μM）可以使DRG神經(jīng)元的動(dòng)作電位去極化時(shí)程明顯延長(zhǎng)，幅度明顯減小。而大

18、鼠足底注射CFA(100μl)1天或melittin(100μg/100μl)2小時(shí)后，TTX的對(duì)動(dòng)作電位幅度和去極化時(shí)程的影響明顯減弱了。結(jié)果提示：外周致炎處理后，形成動(dòng)作電位的上升支和去極化時(shí)程的TTX-R鈉電流成分顯著增加。
　　4.TTX非敏感鈉通道表達(dá)上調(diào)是導(dǎo)致初級(jí)感覺(jué)神經(jīng)元?jiǎng)幼麟娢豢臻g可塑性的離子通道機(jī)制
　　1）免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示：正常情況下，大鼠NaV1.8主要表達(dá)在中小直徑神經(jīng)元，而NaV1.9僅在小直徑

19、神經(jīng)元有表達(dá)。CFA或melittin致炎后，NaV1.8陽(yáng)性神經(jīng)元平均計(jì)數(shù)分別增加了93％和50％，NaV1.9陽(yáng)性神經(jīng)元平均計(jì)數(shù)分別增加了74％和47％。
　　2）Western blot結(jié)果顯示：正常情況下，大鼠DRG神經(jīng)元中NaV1.8和NaV1.9蛋白低表達(dá)。CFA處理組和melittin處理組中NaV1.8蛋白分別增加了84.25％和55.06％，而NaV1.9蛋白分別增加了51.97％和37.64％。
　　3）

20、RT-PCR結(jié)果顯示：正常情況下，大鼠DRG神經(jīng)元中NaV1.8和NaV1.9的處于低水平表達(dá)。CFA或melittin處理后NaV1.8的基因水平分別增加了116.02％和82.01％，而NaV1.9分別增加了87.86％和43.36％。
　　4）膜片鉗記錄TTX-R鈉電流的結(jié)果顯示：大鼠足底注射CFA(100μl)1天或melittin(100μg/100μl)2小時(shí)后，NaV1.8鈉電流和NaV1.9鈉電流均顯著增加。