葉酸受體靶向伊馬替尼脂質(zhì)體及阿霉素-伊馬替尼復(fù)方脂質(zhì)體的研究.pdf

1、血小板衍生生長因子受體（PDGFR）在宮頸癌組織中有高水平的表達(dá)，且在宮頸癌的發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮著重要的作用。PDGFR是甲磺酸伊馬替尼（IM）的主要作用靶點之一，體外研究證明，IM能夠與PDGFR上的特殊位點結(jié)合，阻斷受體磷酸化，從而導(dǎo)致宮頸癌細(xì)胞的凋亡和死亡。但當(dāng)IM在臨床上用于治療宮頸癌疾病時，療效卻很不顯著。藥物向腫瘤組織傳遞的不充分以及IM高的血漿蛋白結(jié)合率在很大程度上導(dǎo)致了這種失敗。脂質(zhì)體作為一種納米級藥物傳遞系統(tǒng)能夠發(fā)揮

2、靶向腫瘤的作用。因此本研究通過將IM裝載入脂質(zhì)體中，并在制備脂質(zhì)體的材料中加入葉酸修飾的脂質(zhì)材料，制成葉酸受體靶向伊馬替尼脂質(zhì)體，從而實現(xiàn)IM對宮頸癌組織的靶向傳遞，同時減少藥物和血漿蛋白的結(jié)合，提高IM的治療效果。
　　研究表明，IM還能增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對傳統(tǒng)細(xì)胞毒類抗癌藥的化療敏感性。在多種類型腫瘤的體外研究中，IM與細(xì)胞毒類抗癌藥的聯(lián)用能產(chǎn)生相加或協(xié)同的抗腫瘤效果。但藥物聯(lián)用效果在很大程度上受聯(lián)用藥物比例的影響，而這種固定的比例

3、在全身給藥時很難實現(xiàn)，因為藥物有各自不同的體內(nèi)代謝過程。因此，我們嘗試按一定的比例將IM和阿霉素（DOX）同時包入葉酸受體靶向脂質(zhì)體中，從而同步兩藥的體內(nèi)過程，使兩藥在到達(dá)腫瘤組織后能維持合適的比例，發(fā)揮協(xié)同作用，進(jìn)一步提高療效、降低毒性、減少耐藥的產(chǎn)生。
　　在第一章中，我們運用scifinder數(shù)據(jù)庫，對IM的理化性質(zhì)進(jìn)行評價。IM具有弱堿性藥物的特征，在堿性環(huán)境下，油水分布系數(shù)高，呈現(xiàn)脂溶性，溶解度隨pH值得升高而降低。建立

4、了測定脂質(zhì)體中IM含量的分析方法，運用瓊脂糖凝膠柱CL-4B分離脂質(zhì)體和游離藥，并運用HPLC測定脂質(zhì)體中IM含量。選擇硫酸銨梯度法進(jìn)行葉酸受體靶向伊馬替尼脂質(zhì)體(FLI)的制備，同時以包封率為指標(biāo)，對磷脂和膽固醇的比例、硫酸銨的濃度、磷脂濃度、藥脂比四個影響因素進(jìn)行單因素考察，結(jié)果顯示，在氫化大豆磷脂（HSPC）和膽固醇（CHOL）的比例為55:40，硫酸銨溶液濃度為300mM，磷脂濃度為35mg/mL，藥脂比為1:5的條件下，能取得

5、較高的包封率，三批樣品的平均包封率為90.7±0.91％。
　　在第二章中，對FLI的外觀、粒徑及分布、表面電荷、體外釋放、以及儲存穩(wěn)定性進(jìn)行了考察。FLI為淺黃綠色的半透明混懸溶液，色澤均勻，流動性良好。FLI三批樣品的平均粒徑為143.5±2.96nm，多分散指數(shù)為0.123±0.017，Zeta電位為-15.97±1.89mv。從透射電鏡上看，F(xiàn)LI為圓形或類圓形，大小均一。運用動態(tài)透析法考察了FLI的體外釋放情況，在pH7

6、.4的PBS中，藥物釋放非常緩慢，經(jīng)過72h的孵育，只有不到5％的藥物釋放；而在pH5.5的PBS中，藥物釋放加快，72h累計釋放率達(dá)到29.5％左右，說明FLI具備一定程度的pH敏感性。FLI在4℃冰箱保存30天，以粒徑和脂質(zhì)體中藥物存留百分比為指標(biāo)考察脂質(zhì)體儲存穩(wěn)定性，結(jié)果顯示穩(wěn)定性良好。
　　在第三章中，選擇葉酸受體（FR）和PDGFR雙陽性的宮頸癌Hela細(xì)胞來考察FLI的靶向性和抗腫瘤效果。用熒光染料Calcein標(biāo)記脂

7、質(zhì)體，用熒光顯微鏡和流式細(xì)胞分析儀來定量和定性考察Hela細(xì)胞對葉酸受體靶向熒光脂質(zhì)體(FLC)的攝取。熒光顯微鏡觀察的結(jié)果顯示FLC能在葉酸受體調(diào)節(jié)的內(nèi)吞作用下被Hela細(xì)胞特異性攝取，而且這種作用能夠被游離葉酸阻斷。流式細(xì)胞分析的結(jié)果也映證了這一點，經(jīng)過與Hela細(xì)胞共同孵育1小時，F(xiàn)LC組的熒光強(qiáng)度是非靶向熒光脂質(zhì)體（LC）組的近40倍。運用MTT法比較了FLI和LI對Hela細(xì)胞的增殖抑制作用，結(jié)果顯示FLI具有更強(qiáng)的抗腫瘤效果

8、，其對Hela細(xì)胞的增殖抑制作用是LI的6倍。進(jìn)一步考察了FLI誘導(dǎo)Hela細(xì)胞凋亡的能力，結(jié)果顯示相比LI，F(xiàn)LI能通過分子靶向和主動靶向的結(jié)合誘導(dǎo)更多的細(xì)胞凋亡。
　　在第四章中，選擇昆明雌性小鼠考察FLI、LI、以及游離IM在小鼠體內(nèi)的藥代動力學(xué)特征。建立HPLC測定血漿中IM含量的方法學(xué)。將測得的不同給藥組各時間點的血藥濃度對時間做圖，繪制血藥濃度經(jīng)時曲線，并用WinNonlin軟件計算各藥動學(xué)參數(shù)。從結(jié)果來看，相比游離藥

9、，脂質(zhì)體形式具有更大的曲線下面積，更低的體內(nèi)清除率，更長的消除半衰期和滯留時間，體現(xiàn)出明顯的長循環(huán)特征。這種藥動學(xué)特征有利于脂質(zhì)體加強(qiáng)對腫瘤組織的灌注，發(fā)揮被動靶向腫瘤的作用。
　　在第五章中，選擇MTT法檢測伊馬替尼（IM）和阿霉素（DOX）單用或聯(lián)用對Hela細(xì)胞的增殖抑制率，并選用半效方法（Median-effect Method）和藥物聯(lián)用指數(shù)（CI，combination index）來評價兩藥聯(lián)用的效果，同時篩選合適的

10、聯(lián)用比例。兩種藥物單獨使用時，均能有效抑制Hela細(xì)胞的生長增殖，且呈濃度依賴性。相比IM，Hela細(xì)胞對DOX的敏感性更強(qiáng)，其IC50是IM的1/26。兩藥聯(lián)用比DOX單用均表現(xiàn)出更強(qiáng)的腫瘤細(xì)胞生長抑制作用。運用CI值對兩藥聯(lián)合作用進(jìn)行評價，發(fā)現(xiàn)三種不同比例的DOX和IM聯(lián)合作用于Hela細(xì)胞在高效應(yīng)區(qū)均表現(xiàn)出協(xié)同抗腫瘤作用(CI<1)，說明伊馬替尼能提高腫瘤細(xì)胞對阿霉素的敏感性。當(dāng)DOX和IM的比例為1:15時，CI值最小，協(xié)同作用

11、最強(qiáng)，故選擇該比例制備阿霉素-伊馬替尼復(fù)方脂質(zhì)體。
　　在第六章中，建立了測定脂質(zhì)體中DOX含量的分析方法，運用瓊脂糖凝膠柱CL-4B分離脂質(zhì)體和游離藥，并運用HPLC測定脂質(zhì)體中DOX含量。在FLI處方優(yōu)化的基礎(chǔ)上，選擇硫酸銨梯度法制備葉酸受體靶向阿霉素-伊馬替尼聯(lián)合脂質(zhì)體（FLDI），并以IM包封率和聯(lián)用藥比例為指標(biāo)，進(jìn)一步考察藥脂比和載藥順序?qū)LDI制備的影響，結(jié)果顯示在藥脂比為1:8，將DOX和IM混合后同時載入脂質(zhì)體能

12、得到比較理想的結(jié)果。同時，還對葉酸受體靶向阿霉素-伊馬替尼復(fù)方pH敏感脂質(zhì)體（FPLDI）進(jìn)行了研制，以改良的硫酸銨梯度法制備，考察磷脂比例、水化溶液pH值、磷脂濃度和藥脂比對脂質(zhì)體制備的影響。結(jié)果顯示，在DOPE和CHEMS的比例為6:4，硫酸銨pH值為8.5，磷脂濃度為55mg/mL，藥脂比為1:8的條件下，能取得較高的包封率和理想的藥物比例。
　　在第七章中，對兩種葉酸受體靶向阿霉素-伊馬替尼復(fù)方脂質(zhì)體(FLDI和FPLDI

13、)的外觀、粒徑、表面電荷、體外釋放性能、融合性能以及儲存穩(wěn)定性進(jìn)行了考察。兩種脂質(zhì)體均為半透明紅色均一的混懸液。FLDI的粒徑和電位分別為145.6±1.26 nm和-16.41±1.73 mv，F(xiàn)PLDI的粒徑和電位分別為170.2±2.47 nm和-36.45±2.56 mv。從透射電鏡上看，兩種脂質(zhì)體均為圓形或類圓形，大小均一。運用動態(tài)透析法考察了兩藥的體外釋放情況，無論FLDI還是FPLDI在pH7.4的環(huán)境中，DOX和IM的釋

14、放均不足5％；而在pH5.5的環(huán)境中，DOX和IM從FLDI中的釋放有所提高分別為11.2％和19.3％，但相比葉酸受體靶向阿霉素單藥脂質(zhì)體FLD，復(fù)方脂質(zhì)體FLDI中DOX的釋放明顯減慢，24h的累積釋放率降低了近60％。與此不同，F(xiàn)PLDI在酸性環(huán)境中表現(xiàn)出非常強(qiáng)的pH敏感性，兩種藥物從FPLDI中的釋放顯著加快并基本同步，24h累計釋放率均達(dá)到90％左右。FLDI在兩種pH環(huán)境中均不具有融合性能，而FPLDI在pH5.5的環(huán)境中，

15、粒徑迅速增大，脂質(zhì)體發(fā)生融合。兩種脂質(zhì)體在4℃冰箱保存30天，以粒徑和脂質(zhì)體中藥物存留百分比為指標(biāo)考察脂質(zhì)體儲存穩(wěn)定性，結(jié)果顯示兩種脂質(zhì)體在該條件下穩(wěn)定性較好。
　　在第八章中，運用熒光顯微鏡法和流式細(xì)胞分析儀考察了Hela細(xì)胞對兩種葉酸受體靶向復(fù)方脂質(zhì)體FLDI和FPLDI的特異性攝取。熒光顯微鏡觀察的結(jié)果顯示這兩種脂質(zhì)體均能在葉酸受體的介導(dǎo)下被Hela細(xì)胞特異性攝取，而且這種作用能夠被葉酸阻斷。流式細(xì)胞分析的結(jié)果也證實，經(jīng)過與

16、Hela細(xì)胞共同孵育1小時，F(xiàn)LDI組和FPLDI組的熒光強(qiáng)度分別是是非靶向脂質(zhì)體LDI組和PLDI組熒光強(qiáng)度的7.5和8.4倍。本章還運用MTT法比較了復(fù)方脂質(zhì)體和單藥脂質(zhì)體對Hela細(xì)胞的增殖抑制效果，F(xiàn)PLDI、FPLD、FLDI、FLD的IC50值分別為2.89±0.34、5.22±0.56、14.8±1.53、9.38±0.83μM。相比FPLD，pH敏感復(fù)方脂質(zhì)體FPLDI能夠通過藥物聯(lián)合作用顯著增強(qiáng)對Hela細(xì)胞的增殖抑制

17、效果。而非pH敏感的復(fù)方脂質(zhì)體FLDI對Hela細(xì)胞的作用效果卻不如單藥脂質(zhì)體FLD，因為IM在復(fù)方脂質(zhì)體內(nèi)水相形成的膠態(tài)沉淀限制了DOX的釋放。
　　綜上所述，葉酸受體靶向伊馬替尼脂質(zhì)體能夠通過分子靶向和主動靶向作用的聯(lián)合增強(qiáng)伊馬替尼對宮頸癌Hela細(xì)胞的凋亡和殺傷作用，將是一種很有潛力的治療策略應(yīng)用于宮頸癌的治療中。葉酸受體靶向阿霉素-伊馬替尼復(fù)方pH敏感脂質(zhì)體能夠同步聯(lián)用藥物的體內(nèi)過程，在靶組織迅速釋放藥物并保持合適的藥物聯(lián)