靶向CX3CL1的RNA干擾在病毒性肝炎及癌癥中的治療作用.pdf

1、在1999年9月份，當一個正在通過肝動脈給藥，接受高滴度腺病毒載體治療的病人死于病毒載體所引發(fā)的毒性反應后，人們對于腺病毒(Ad)載體用于臨床基因治療的理解發(fā)生了轉(zhuǎn)變。當然，在臨床治療中所需的對腺病毒載體的連續(xù)性給藥可能關系到機體對腺病毒的強烈反應，但是更重要的是，通過研究人們獲得了更多的對腺病毒毒性的了解。我們都意識到，沒有哪一種載體系統(tǒng)是完美無缺的。在看到腺病毒載體并不適于所有治療應用的同時，我們也不會因此而忽略腺病毒載體那些相對于

2、其他載體系統(tǒng)的顯著優(yōu)點：能夠有效地感染靜息或分裂中細胞，這是很多載體無法做到的；腺病毒能夠在短時間內(nèi)實現(xiàn)高水平的基因表達，這對于那些只需要短期高表達轉(zhuǎn)基因就能產(chǎn)生足夠治療效應的應用意義重大。腺病毒載體潛在應用包括治療性的血管生成作用，能夠在中央神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)實施感染，以及在那些腺病毒的毒副作用也能產(chǎn)生幫助的治療當中如作為腫瘤疫苗。當然毫無疑問的是，為了更廣泛地應用腺病毒載體，解決其引起體內(nèi)免疫應答的問題是當務之急。本次研究集中在腺病

3、毒誘導的肝臟損傷，誘導體內(nèi)肝臟抗病毒免疫抑制和黑色素瘤基因治療方面，獲得了如下的結果： 1、新型高壓注射重組腺病毒誘導肝損傷模型的建立目前，腺病毒載體能在肝臟中定位并引起肝臟炎癥和損傷的研究甚多，但是通用的動物模型研究并不多。本部分研究的目的就是建立一種新的腺病毒誘導的爆發(fā)性肝炎模型，來促進對腺病毒誘導的自身免疫性肝炎的機制研究。我們采用了高壓注射(注射體積占體重10％，并在7秒中內(nèi)完成注射)腺病毒載體的方法，將腺病毒載體快速地

4、特異地通過尾靜脈傳遞到小鼠肝臟內(nèi)部，觀察后繼的病毒感染引起的肝臟損傷。C57 BL/6小鼠尾靜脈高壓注射表達不同產(chǎn)物的腺病毒(AdLacZ，AdEGFP，AdsiNeg)，通過流式細胞術分析肝臟內(nèi)部淋巴細胞的比例和絕對數(shù)，血清轉(zhuǎn)氨酶和H&E染色被用作評價肝臟損傷的指標。我們發(fā)現(xiàn)，高壓注射腺病毒比普通注射誘導更加嚴重的肝臟炎癥：大量的單個核細胞迅速浸潤，尤其是肝臟NK細胞顯著增加和活化；同時發(fā)現(xiàn)血清ALT轉(zhuǎn)氨酶水平大幅升高；肝臟內(nèi)出現(xiàn)多處

5、壞死：IFN-γ在肝臟中的轉(zhuǎn)錄水平及在血清中蛋白水平上升。通過注射抗體預先清除NK細胞，可以顯著減輕腺病毒誘導的肝臟損傷以及炎癥因子IFN-γ的表達水平。這些數(shù)據(jù)表明腺病毒感染誘導了肝臟中NK細胞的浸潤和活化，從而導致了肝細胞的損傷以及肝臟炎癥的產(chǎn)生，NK細胞是該模型中病毒感染引發(fā)的早期炎癥的主要效應細胞?？偟膩碚f，我們的工作展示了一個與人的急性肝臟感染相關的新的病毒肝炎模型，為研究腺病毒提供了一個實用有效的工具和平臺。 2、治療性RN

6、A干擾CX3CL1抑制腺病毒引起的肝臟損傷我們研究了趨化因子CX3CL1/fractalkine(FKN)在抗病毒感染免疫應答中的作用。FKN是一種CX3C類的趨化因子，有膜結合型和分泌型兩種存在形式。大部分NK細胞，CD14<'+>單核細胞及部分的CD8<'+>T細胞表達相應受體CX3CR1。通過進一步研究以上構建的高壓注射腺病毒誘導的肝臟損傷模型，我們發(fā)現(xiàn)CX3CL1在腺病毒感染的肝臟中是顯著上調(diào)的，并且有意思的是同時發(fā)現(xiàn)浸潤到炎癥

7、肝臟中的主要效應細胞NK細胞上相應受體的CX3CR1表達也顯著上調(diào)。為了進一步證明二者關系，我們構建了表達重組小鼠CX3CL1的腺病毒進行注射，發(fā)現(xiàn)在肝臟內(nèi)過表達CX3CL1大大增加了CX3CR1<'+>NK細胞的浸潤和活化水平，血清中ALT轉(zhuǎn)氨酶的水平及肝臟壞死程度也大幅升高。這表明腺病毒感染肝臟后誘導肝臟內(nèi)CX3CL1的表達增加，CX3CL1與其受體CX3CR1相互作用在NK細胞的招募和活化以及IFN-γ的產(chǎn)生中行使重要的作用。因此

8、，抑制CX3CL1的表達將可作為抗腺病毒炎癥治療的一個選擇。實驗中，運用高壓注射表達CX3CL1特異性干擾小RNA的腺病毒進行了體內(nèi)RNA干擾，發(fā)現(xiàn)病毒感染后CX3CL1在肝臟中的表達水平被明顯抑制，相應地，NK細胞的浸潤及肝臟損傷和炎癥也顯著下調(diào)。為了更好地驗證CX3CL1的促炎癥作用，我們在注射腺病毒之前用CX3CL1或CX3CR1的阻斷抗體預先處理小鼠，結果顯示肝臟中的炎癥損傷及淋巴細胞浸潤也能被很好地抑制。綜上，該實驗證明了CX

9、3CL1-CX3CR1趨化因子系統(tǒng)在腺病毒誘導的肝臟損傷中的促炎癥功能和重要性，并為體內(nèi)基因治療提供了一個新的靶點和手段。 3、RNA干擾CX3CL1抑制黑色素瘤體內(nèi)生長及機制研究雖然有報道稱過表達的CX3CL1促進對腫瘤細胞的殺傷，CX3CL1行使的是抑制腫瘤生長的作用。而我們的研究經(jīng)RT-PCR，Western Blotting以及免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn)小鼠黑色素瘤B16-F0細胞及一些腫瘤病人的實體瘤表達CX3CL1。

10、進一步的流式細胞術抗體檢測發(fā)現(xiàn)B16上CX3CL1為陽性，而ELISA檢測發(fā)現(xiàn)B16的培養(yǎng)上清中無可溶性FKN的表達，這證明了B16表達的CX3CL1為膜結合型。因此我們猜測這種膜結合型的CX3CL1可能參與了腫瘤的發(fā)生過程。運用表達CX3CL1特異性干擾小RNA的腺病毒感染B16-F0黑色素瘤細胞，沉默了B16細胞上CX3CL1的表達。通過流式細胞分選技術篩選得到CX3CL1表達被有效抑制的B16細胞。在C57 BL/6小鼠上進行體內(nèi)

11、荷瘤的結果發(fā)現(xiàn)CX3CL1敲除鼠與對照組相比腫瘤的成瘤性大幅降低：生存曲線數(shù)據(jù)表明CX3CL1敲除組的小鼠的生存情況要顯著優(yōu)于對照組。對腫瘤切片加以研究發(fā)現(xiàn)，血管內(nèi)皮細胞表達CX3CL1的受體CX3CR1；CX3CL1敲除組的腫瘤生長受到嚴重抑制且瘤體內(nèi)部和周圍只有少量的血管生成，而對照組腫瘤生長旺盛，并伴隨著大量的腫瘤內(nèi)血管分布。因此我們有理由認為腫瘤表達一定水平的CX3CL1來促進它們自身與體內(nèi)表達CX3CR1的血管內(nèi)皮細胞相互作用