自噬在涎腺腺樣囊性癌化療中的作用及其相關(guān)蛋白與臨床預(yù)后的相關(guān)性.pdf

1、第一部分：自噬在涎腺腺樣囊性癌順鉑化療中的作用
　　 研究目的：
　　 1.分析應(yīng)用自噬抑制劑對(duì)順鉑(cis-Dichlorodiamineplatinum，DDP)誘導(dǎo)涎腺腺樣囊性癌細(xì)胞死亡和細(xì)胞凋亡的影響。
　　 2.分析應(yīng)用轉(zhuǎn)染技術(shù)沉默自噬基因抑制自噬對(duì)涎腺腺樣囊性癌細(xì)胞死亡和細(xì)胞凋亡的影響。
　　 3.分析Bcl-2在DDP誘導(dǎo)涎腺腺樣囊性癌細(xì)胞自噬和細(xì)胞凋亡中的變化。
　　 4.分析P5

2、3-AMPK-mTOR相關(guān)蛋白是否參與了DDP誘導(dǎo)的自噬反應(yīng)。
　　 5.分析自噬抑制劑在DDP治療ACC-M移植瘤中的作用。
　　 研究方法：
　　 1.MTT實(shí)驗(yàn)及流式細(xì)胞儀分別檢測(cè)應(yīng)用自噬抑制劑或沉默自噬基因抑制自噬前后DDP誘導(dǎo)涎腺腺樣囊性癌細(xì)胞死亡和細(xì)胞凋亡的變化。Western blot檢測(cè)凋亡蛋白actived-caspase-3。
　　 2.電鏡及熒光顯微鏡檢測(cè)DDP誘導(dǎo)涎腺腺樣囊性癌細(xì)胞

3、自噬的變化。Western blot檢測(cè)自噬標(biāo)志蛋白LC3。
　　 3.Western blot檢測(cè)Bcl-2及P53-AMPK-mTOR相關(guān)蛋白。
　　 4.構(gòu)建ACC-M移植瘤，檢測(cè)應(yīng)用自噬抑制劑前后腫瘤體積及重量的變化，免疫組化檢測(cè)實(shí)體瘤中自噬標(biāo)志蛋白LC3的變化。
　　 研究結(jié)果：
　　 1.3-MA增加DDP誘導(dǎo)涎腺腺樣囊性癌細(xì)胞死亡，同時(shí)促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡。
　　 MTT結(jié)果顯示DDP處理

4、ACC-M細(xì)胞的24小時(shí)IC50為11.34±0.92μg/mL。因此，在隨后的實(shí)驗(yàn)中使用，采用濃度為10μg/mLDDP處理ACC-M24小時(shí)。與對(duì)照組相比，DDP療組的ACC-M細(xì)胞活力下降了約61.02％;3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine，3-MA)和DDP聯(lián)合治療組的細(xì)胞死亡率增加了約78.73％。3-MA組的細(xì)胞死亡率較對(duì)照組無(wú)明顯差別。
　　 用流式細(xì)胞儀AnnexinV-FITC和碘化丙啶(PI)染色

5、檢測(cè)細(xì)胞凋亡;用Westernblot檢測(cè)actived-caspase-3。與DDP組相比，DDP和3-MA聯(lián)合處理組的ACC-M細(xì)胞凋亡率顯著增加，從19.08％增加到約29.72％。通過(guò)Westernblot檢測(cè)下游凋亡通路的capase-3的活性形式cis-Dichlorodiamineplatinumactived-caspase-3。與DDP組相比，3-MA和DDP聯(lián)合治療組中的actived-caspase-3增加了約36

6、.36％。
　　 3-MA是一個(gè)眾所周知的自噬抑制劑，它可抑制typeⅠPI3K活性，而typeⅠPI3K是自噬體形成過(guò)程中必不可少的因子;DDP可誘導(dǎo)細(xì)胞自噬，這些在我們的實(shí)驗(yàn)中被再次證實(shí)。我們?cè)陔娮语@微鏡下發(fā)現(xiàn)DDP誘導(dǎo)ACC-M細(xì)胞產(chǎn)生的自噬體。為了證實(shí)3-MA可抑制順鉑誘導(dǎo)ACC-M細(xì)胞自噬，我們用GFP-LC3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞并檢測(cè)GFP分布。LC3是一種微管相關(guān)蛋白，是自噬體的重要組成部分。GFP-LC3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞已成

7、為一個(gè)檢測(cè)自噬體有效的手段。在對(duì)照組中，觀察到ACC-M細(xì)胞胞漿中散在點(diǎn)狀熒光，而DDP處理的細(xì)胞表現(xiàn)出點(diǎn)狀熒光增加，且表達(dá)點(diǎn)狀熒光的細(xì)胞數(shù)明顯增加。點(diǎn)狀熒光增加表明自噬細(xì)胞的存在。研究發(fā)現(xiàn)DDP和3-MA聯(lián)合治療組與順鉑組相比，表達(dá)點(diǎn)狀熒光細(xì)胞減少了約64.29％。
　　 LC3-Ⅰ轉(zhuǎn)換成LC3-Ⅱ的程度與細(xì)胞自噬的水平正相關(guān)，Westernblot檢測(cè)LC3-Ⅱ，LC3-Ⅱ帶密度代表自噬水平。順鉑治療誘導(dǎo)ACC-M細(xì)胞LC3

8、-Ⅱ表達(dá)，但3-MA使其表達(dá)減少約52.83％。除了LC3用作自噬的檢測(cè)外，p62/SQSTM1蛋白作為L(zhǎng)C3和泛素化底物之間的連接，也被用于自噬的檢測(cè)。Westernblot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)DDP和3-MA聯(lián)合治療組與順鉑治療組相比，p62的蛋白水平增加了約36.51％。
　　 總體而言，順鉑(DDP)治療誘導(dǎo)了ACC-M細(xì)胞自噬，但3-MA抑制了細(xì)胞自噬和增強(qiáng)了DDP誘導(dǎo)ACC-M的細(xì)胞死亡，增加了caspase途徑的細(xì)胞凋亡。

9、r>　　 2.Beclin-1siRNA促進(jìn)涎腺腺樣囊性癌的細(xì)胞凋亡，增加癌細(xì)胞死亡。
　　 Beclin-1是自噬過(guò)程中的一個(gè)關(guān)鍵的起始蛋白質(zhì)。為了更直接的觀察抑制自噬的對(duì)涎腺腺樣囊性癌細(xì)胞的影響，我們使用Beclin-1siRNA降低內(nèi)源性beclin-1的表達(dá)。轉(zhuǎn)染后24小時(shí)，Western blot檢測(cè)到干擾后ACC-M細(xì)胞中內(nèi)源性Beclin-1與對(duì)照組相比，減少了約56.60％。
　　 此外，采用流式細(xì)胞儀

10、AnnexinV-PE和7AAD的染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡率和Western blot檢測(cè)actived-caspase-3。與DDP組相比，DDP和Beclin-1siRNA聯(lián)合組ACC-M細(xì)胞的凋亡率顯著增加:從18.78％增加到30.41％。此外，與DDP組相比，DDP和Beclin-1siRNA聯(lián)合組actived-caspase-3增加了35.19％。
　　 在我們的實(shí)驗(yàn)中證實(shí)了DDP誘導(dǎo)細(xì)胞自噬和Beclin-1siRNA抑

11、制自噬。我們觀察到，與DDP組相比，DDP與Beclin-1siRNA聯(lián)合組中ACC-M自噬細(xì)胞減少了約80.32％。DDP組ACC-M細(xì)胞中LC3-Ⅱ明顯增加，但與DDP組相比，DDP和Beclin-1siRNA聯(lián)合組LC3-Ⅱ減少了約61.11％。相應(yīng)地，與DDP治療相比，DDP和Beclin-1siRNA聯(lián)合組的p62蛋白表達(dá)增加了約100％。
　　 總體而言，順鉑(DDP)誘導(dǎo)了ACC-M細(xì)胞自噬，BeclinlsiRN

12、A抑制細(xì)胞自噬和增強(qiáng)了DDP誘導(dǎo)ACC-M細(xì)胞死亡，提高了caspase途徑細(xì)胞凋亡。
　　 3.Bcl-2蛋白可能是細(xì)胞凋亡和自噬之間的聯(lián)系蛋白;P53-AMPK-mTOR信號(hào)通路可能參與了DDP誘導(dǎo)的自噬反應(yīng)。
　　 以上結(jié)果發(fā)現(xiàn)DDP誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和自噬之間可能有串?dāng)_，因此我們檢測(cè)了Bcl-2的表達(dá)。通過(guò)Western blot分析，我們發(fā)現(xiàn)DDP可提高ACC-M細(xì)胞中Bcl-2的表達(dá)，而B(niǎo)eclin-1siRNA

13、可使增加的Bcl-2減少。因此，在我們的實(shí)驗(yàn)中Bcl-2蛋白可能是自噬和凋亡途徑之間的聯(lián)系蛋白。
　　 此外，我們探索了DDP誘導(dǎo)自噬的基本機(jī)制。通過(guò)Western blot法，我們發(fā)現(xiàn)在ACC-M細(xì)胞中DDP處理組腫瘤抑制基因P53和AMP激活的蛋白激酶(AMPK)磷酸化增加，哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)磷酸化顯著下降。
　　 4.DDP和3-MA聯(lián)合對(duì)ACC-M移植瘤的抗癌作用。
　　 為了進(jìn)一步驗(yàn)證自

14、噬在體內(nèi)涎腺腺樣囊性癌細(xì)胞的作用，我們構(gòu)建了ACC-M裸鼠移植瘤。結(jié)果顯示各分組之間荷瘤鼠體重?zé)o顯著差異。與順鉑組及空白對(duì)照組相比，順鉑和3-MA聯(lián)合組的腫瘤生長(zhǎng)被顯著抑制。與空白對(duì)照相比，3-MA組的腫瘤生長(zhǎng)沒(méi)有明顯變化。30天時(shí)，與DDP組相比較，順鉑和3-MA聯(lián)合組的小鼠腫瘤體積和腫瘤重量分別顯著減少了53.64％和59.75％。免疫組織化學(xué)分析結(jié)果示DDP組移植瘤組織中LC3的表達(dá)明顯高于其他三組。這些結(jié)果表明DDP和3-MA聯(lián)

15、合能夠抑制涎腺腺樣囊性癌細(xì)胞自噬及其移植瘤的生長(zhǎng)。
　　 結(jié)論：
　　 1.3-MA增加DDP誘導(dǎo)涎腺腺樣囊性癌細(xì)胞死亡，同時(shí)促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡。
　　 2.Beclin-1siRNA促進(jìn)涎腺腺樣囊性癌的細(xì)胞凋亡，增加癌細(xì)胞死亡。
　　 3.Bcl-2蛋白可能是細(xì)胞凋亡和自噬之間的聯(lián)系蛋白;P53-AMPK-mTOR信號(hào)可能參與了DDP誘導(dǎo)的自噬反應(yīng)。
　　 4.DDP和3-MA聯(lián)合對(duì)ACC-M移植瘤

16、的抗癌作用。
　　 第二部分：自噬相關(guān)相關(guān)蛋白和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白在頭頸部涎腺腺樣囊性癌中的表達(dá)
　　 自噬是細(xì)胞內(nèi)源性途徑，它在細(xì)胞應(yīng)激和營(yíng)養(yǎng)缺乏狀態(tài)下可維持能量平衡和高分子合成，促進(jìn)細(xì)胞存活。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是在細(xì)胞應(yīng)激和營(yíng)養(yǎng)缺乏狀態(tài)下生理功能的中斷導(dǎo)致未折疊蛋白的積累和誘導(dǎo)未折疊蛋白應(yīng)答的過(guò)程。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和自噬均與人類(lèi)癌癥有關(guān)。我們研究了自噬相關(guān)蛋白（LC3和Beclin1）和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白(GRP78)在頭頸部涎腺

17、腺樣囊性癌組織中的表達(dá)。79例頭頸部腺樣囊性癌組織的組織標(biāo)本制成組織微陣列芯片用于免疫組化。LC3的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.016)及TNM分期(P=.021)顯著相關(guān)。Beclin1的表達(dá)組織增長(zhǎng)模式(P=0.002)，組織學(xué)分級(jí)(P<.001)及survivial(P<.OOl)顯著相關(guān)。GRP78的表達(dá)組織增長(zhǎng)模式(P=0.019)，組織學(xué)分級(jí)(P=0.019)及survivial(P=0.001)顯著相關(guān)。LC3的表達(dá)與Bec

18、lin1的表達(dá)(P　　 自噬與腫瘤發(fā)生