RhoC蛋白及其抑制劑與涎腺腺樣囊性癌關(guān)系的研究.pdf

1、目的：本實(shí)驗(yàn)擬通過觀察RhoC蛋白在人涎腺腺樣囊性癌肺高轉(zhuǎn)移細(xì)胞株ACC-M中的表達(dá)及抑制劑Y-27632對(duì)該細(xì)胞的作用，初步探討RhoC蛋白在涎腺腺樣囊性癌中的作用及可能作用機(jī)制，為進(jìn)一步研究腺樣囊性癌的生長(zhǎng)、增殖機(jī)理以及尋找新的治療手段提供一定的理論基礎(chǔ)。 材料和方法： 1.材料：人涎腺腺樣囊性癌肺高轉(zhuǎn)移細(xì)胞株ACC—M由上海九院口腔頜面外科腫瘤實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)。羊抗人RhoC多克隆抗體購(gòu)自Santa Cruz生物技術(shù)公司

2、，鼠抗羊藻紅蛋白標(biāo)記熒光二抗購(gòu)自Caltag Laboratories公司；HRP標(biāo)記兔抗羊二抗購(gòu)自KPL公司；Y-27632購(gòu)自Biosource生物公司。 2.方法 1)免疫細(xì)胞化學(xué)ICC的方法檢測(cè)ACC—M細(xì)胞中RhoC的表達(dá)情況，抗RhoC多克隆抗體作用濃度2μg/ml，熒光二抗作用濃度2μg／ml，以熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞胞漿出現(xiàn)藻紅色熒光者為陽(yáng)性。 2)四甲基偶氮唑藍(lán)比色實(shí)驗(yàn)(MTT)檢測(cè)不同濃度Y-2

3、7632對(duì)ACC—M細(xì)胞增殖的影響，給ACC—M細(xì)胞加入含0、2.5、5、10、20μmol／LY-27632的培養(yǎng)基培養(yǎng)24小時(shí)后，加MTT溶液終止培養(yǎng)并測(cè)量光密度值(OD)； 3)形態(tài)學(xué)觀察ROCK抑制劑Y-27632對(duì)ACC—M細(xì)胞的作用，ACC—M細(xì)胞在含10μmol／LY-27632的培養(yǎng)基中培養(yǎng)1小時(shí)后鏡下觀察其形態(tài)改變； 4)Western Blot方法檢測(cè)Y-27632作用下ACC—M細(xì)胞中RhoC蛋白的

4、表達(dá)變化，采用BCA蛋白濃度測(cè)定法進(jìn)行蛋白定量，SDS—PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，一抗二抗孵育，ECL放射顯影定影，Image Pro Plus5.0.2灰度值測(cè)定。結(jié)果用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，采用單因素方差分析。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果： 1)ICC結(jié)果發(fā)現(xiàn)在ACC—M細(xì)胞胞漿中呈現(xiàn)藻紅色熒光，說明RhoC蛋白在ACC—M細(xì)胞中陽(yáng)性表達(dá)； 2)形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)Y-27632作用后的ACC—M細(xì)胞變成梭形，細(xì)胞長(zhǎng)軸

5、增加，細(xì)胞間連接消失，細(xì)胞膜不規(guī)則，皺縮不整齊，邊界有絲狀突起，有傾向凋亡的趨勢(shì)； 3)MTT結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同濃度Y-27632作用下檢測(cè)到的OD值均比對(duì)照組小，在0μmol／L至10μmol／L藥物濃度范圍內(nèi)，隨著濃度升高，所測(cè)得OD值越來越小，在20μmol／L，濃度時(shí)略有上升；這說明抑制劑對(duì)ACC-M細(xì)胞的增殖有一定的抑制作用，且具有一定的濃度依賴性，當(dāng)藥物濃度為10μmol／L時(shí)抑制作用有顯著意義； 4)Wester