葛根提取物對(duì)神經(jīng)根型頸椎病大鼠根性疼痛的作用及機(jī)制研究.pdf

1、一、目的與意義： 頸椎病又稱頸椎綜合癥，是頸部椎間盤、骨骼、軟骨、韌帶發(fā)生退行性變，繼發(fā)性刺激或壓迫周圍或臨近的脊髓、神經(jīng)根、血管、軟組織、交感神經(jīng)等組織結(jié)構(gòu)，并由此而引起各種不適的一組癥候群。神經(jīng)根型頸椎病是頸椎病中發(fā)病率最高的一種類型，約占其總發(fā)病率的60％～70％。神經(jīng)根型頸椎病是神經(jīng)根受各種因素侵襲損傷而導(dǎo)致其支配區(qū)域感覺、運(yùn)動(dòng)及反射障礙而引發(fā)的以疼痛為主要臨床表現(xiàn)的一種疾病。醫(yī)學(xué)界最早關(guān)于頸椎病的概念，大多源于神經(jīng)根型

2、。神經(jīng)根型頸椎病的主要癥狀為根性神經(jīng)痛。目前對(duì)神經(jīng)根型頸椎病根性痛的確切機(jī)制尚不完全清楚，但機(jī)械壓迫因素和生物化學(xué)因素在發(fā)病機(jī)制中的作用得到越來越多的認(rèn)同。 為了研究葛根素治療神經(jīng)根型頸椎病根性痛的可能機(jī)制，探討葛根素對(duì)受損的頸神經(jīng)根的修復(fù)作用，本課題組從神經(jīng)行為學(xué)、神經(jīng)形態(tài)學(xué)和神經(jīng)電生理學(xué)角度進(jìn)行研究，既為了探討葛根對(duì)神經(jīng)根型頸椎病根性痛及其受損神經(jīng)根修復(fù)的作用，也為明確中藥復(fù)方“頸椎舒”的療效機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 二、

3、方法與內(nèi)容： 1.葛根藥材的鑒定 薄層色譜鑒定照薄層色譜法(附錄VIB)試驗(yàn)，吸取上述兩種溶液各10μl，分別點(diǎn)于同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠H薄層板上，使成條狀，以三氯甲烷-甲醇-水(7:2.5:0.25)為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈(365nm)下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜圖相應(yīng)的位置上，顯示相同顏色的熒光斑點(diǎn)。 葛根中葛根素含量的測(cè)定根據(jù)2005版《中國藥典(一部)》中規(guī)定，按照高效

4、液相色譜法測(cè)定，葛根干燥品中葛根素含量不低于2.4％。 2.葛根素最佳提取工藝的確定及質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)的建立 2.1最佳提取工藝的確定以葛根素為指標(biāo)，以料液比(14:1、16:1、18:1)g、提取時(shí)間(1、1.5、2)h、提取次數(shù)(1、2、3)次為考察因素，按L9(34)正交表進(jìn)行正交試驗(yàn)，比較水提取法和乙醇提取法，確定葛根提取的最佳工藝及質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn). 2.2質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)的建立按照最佳提取工藝做三批驗(yàn)證試驗(yàn)求得R

5、SD值，計(jì)算平均濃度。 3.模型的建立及干預(yù) 所有大鼠在造模術(shù)前行左側(cè)SLSEP檢測(cè)，獲取參考值。仿照文獻(xiàn)[13]施行椎管插線造模手術(shù)，略作改進(jìn)：以0.8cm長(zhǎng)、直徑0.55mm尼龍漁線制備成插線，C7椎板開窗后，分別沿脊髓縱軸插入至C7-T1，及C5-C7神經(jīng)根處，部分重疊，牢固嵌入骨性椎管內(nèi)。術(shù)中及術(shù)后死亡7只。余53只大鼠在術(shù)后第5天接受評(píng)價(jià)，篩選符合以下條件：①造模前后術(shù)側(cè)E'-C6Lat的增長(zhǎng)為0.2-0.4m

6、s；②步態(tài)評(píng)分為2-3分，無脊髓壓迫癥狀，共47只大鼠入組。隨機(jī)編號(hào)，使用excel均衡生成5個(gè)處理組，每組8只：生理鹽水組、葛根提取物低、中、高劑量組、頸復(fù)康組。頸復(fù)康組用頸復(fù)康顆粒配制成密度為1:1溶液，所有處理組給藥均定容到3ml灌胃。治療期間對(duì)大鼠進(jìn)行行為學(xué)觀察記錄自發(fā)疼痛行為和步態(tài)異常評(píng)分，治療10天后行正中神經(jīng)短潛伏期體感誘發(fā)電位(SLSEP)測(cè)定和壓線段脊髓及神經(jīng)根病理切片的制作與觀察。 4.葛根提取物對(duì)受損神經(jīng)根

7、修復(fù)作用的評(píng)價(jià) 行為學(xué)觀察實(shí)驗(yàn)開始及結(jié)束時(shí)分別測(cè)量大鼠體重；每日在9:00-10:30間將大鼠放置在觀察箱中30min后觀察：有無自噬、舔咬、嘶叫等；記錄5min(300s)內(nèi)患肢離地的累積時(shí)間，取三次的平均值；結(jié)合Kawakami與Dubuisson法對(duì)其由疼痛攣縮造成的步態(tài)障礙進(jìn)行評(píng)估：1分=正常步態(tài)、足無畸形；2分=受損傷足輕觸玻璃臺(tái)面，不持重或輕微持重，走時(shí)跛行；足內(nèi)收蜷縮畸形；3分=受損足抬起，走動(dòng)時(shí)不著臺(tái)面；伴明顯足

8、內(nèi)收蜷縮畸形。 正中神經(jīng)短潛伏期體感誘發(fā)電位(SLSEP)測(cè)定方法如文獻(xiàn)[13]，刺激和記錄均使用2402號(hào)針灸針，參考電極置于附近1cm處皮下，刺激正中神經(jīng)。記錄并計(jì)算術(shù)側(cè)Erb's點(diǎn)與C6椎板上點(diǎn)潛伏期的差值(E'-C6Lat)、C6椎板上點(diǎn)波幅(C6Amp)，Erb's點(diǎn)與C6椎板測(cè)量點(diǎn)距離，計(jì)算體感誘發(fā)電位傳導(dǎo)速度(MCV)。 病理切片的制作與觀察大鼠各項(xiàng)指標(biāo)檢測(cè)完成后，大劑量麻醉致死，迅速取出壓線段脊髓及神經(jīng)根

9、，固定、石蠟包埋，進(jìn)行HE染色，光鏡下觀察軸索、髓鞘和神經(jīng)元的形態(tài)及神經(jīng)內(nèi)膜及間質(zhì)內(nèi)血管的變化、是否有異常物質(zhì)的沉積和炎癥細(xì)胞的浸潤等來明確病變性質(zhì)；分別統(tǒng)計(jì)各組：神經(jīng)細(xì)胞空泡樣變、壞死灶、軸突扭曲髓鞘脫失呈魚骨狀等陽性病變的病例數(shù)。 5.數(shù)據(jù)處理 提取工藝的優(yōu)化使用正交設(shè)計(jì)(Orthogonaldesign)；使用SPSS11.5行單因素重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)的方差分析(RepeatedMeasures)，Mauchly球形檢驗(yàn)

10、結(jié)果，若P>0.05，滿足球形假設(shè)，無需校正；若P≤0.05，則不滿足球形假設(shè)，用ε校正系數(shù)為Greenhouse-Geisser校正的結(jié)果。計(jì)量數(shù)據(jù)用均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)描述，治療前后用配對(duì)t檢驗(yàn)，各組間比較用單向方差分析(One-WayANOVA)。 三、結(jié)果： 實(shí)驗(yàn)大鼠均無明顯的體重減輕，傷口愈合良好，無自噬及舔咬，無膿性分泌物。 1.葛根提取物對(duì)大鼠頸神經(jīng)根性疼痛行為的影響 在術(shù)后5天時(shí)，分別評(píng)

11、價(jià)各組自發(fā)疼痛行為和步態(tài)異常評(píng)分差異無顯著性意義(P>0.05)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，生理鹽水組的大鼠上肢仍彎曲緊貼胸口，其前肢避免觸地，觸地部位為肘部，其5分鐘內(nèi)前肢離地時(shí)間值無明顯變化，步態(tài)蹣跚，軀體傾斜；EP高、中、低劑量治療組的大鼠疼痛相關(guān)行為明顯減輕，四肢趨向于平等支持體重，腕部或爪背部觸地，呈稍不平衡步態(tài)。 2.葛根提取物對(duì)大鼠受損神經(jīng)根修復(fù)的影響 生理鹽水組大鼠的組織病理切片形態(tài)學(xué)觀察見神經(jīng)元壞死，假單極神經(jīng)細(xì)胞結(jié)

12、構(gòu)消失，形成衛(wèi)星細(xì)胞環(huán)繞的空洞；后根神經(jīng)軸突及膜細(xì)胞結(jié)構(gòu)不清，雪旺細(xì)胞核堆積，軸突有斷裂，周圍銹鞘消失，形成空洞；脊髓白質(zhì)的后索、外側(cè)索呈空泡樣變性，脊髓灰質(zhì)、白質(zhì)處均有膠質(zhì)細(xì)胞增生。葛根提取物高、中、低劑量組和頸復(fù)康組神經(jīng)損傷程度較輕，出現(xiàn)節(jié)細(xì)胞空泡變性，壞死及髓鞘魚骨變的例數(shù)較少，提示葛根提取物對(duì)大鼠受損神經(jīng)有修復(fù)和保護(hù)作用。 3.葛根提取物對(duì)大鼠受損神經(jīng)根電生理的影響 3.1對(duì)C6椎板上點(diǎn)波幅(C6Amp)的影響不

13、同組之間評(píng)分結(jié)果無顯著性差異(F=6.878，P<0.001)，治療前后評(píng)分結(jié)果有顯著差異(F=1394.719，P<0.001)；在不同分組之間，除生理鹽水組(t=0.890，P=0.403)無顯著性差異，其余各組經(jīng)配對(duì)t檢驗(yàn)，結(jié)果均有顯著差異，t值分別為28.714、17.540、12.529和21.616，均為P<0.001。從不同組來看，治療前差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.822，P=0.520)，治療后評(píng)分結(jié)果差異有顯著差異(F

14、=14.432，P<0.001)，其中以頸復(fù)康組療效最顯著。各組與治療前后之間存在交互效應(yīng)(F=93.059，P<0.001)，由表可知，治療后波幅的最大值在頸復(fù)康組，最小值在治療后生理鹽水組； 3.2對(duì)潛伏期的差值(E'-C6Lat)的影響不同組之間評(píng)分結(jié)果無顯著性差異(F=20.025，P<0.001)，治療前后評(píng)分結(jié)果有顯著差異(F=384.062，P<0.001)；在不同分組之間，除生理鹽水組(t=0.314，P=0.7

15、63)無顯著性差異，其余各組經(jīng)配對(duì)t檢驗(yàn)，結(jié)果均有顯著差異，t值分別為11.081、9.178、16.024和10.299，均為P<0.001。從不同組來看，治療前差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.368，P=0.830)，治療后評(píng)分結(jié)果差異有顯著差異(F=39.430，P<0.001)，其中以頸復(fù)康組療效最顯著。各組與治療前后之間存在交互效應(yīng)(F=27.133，P<0.001)，由表可知，治療后潛伏期差值的最大值在生理鹽水組，最小值在治療后

16、頸復(fù)康組； 3.3對(duì)體感誘發(fā)電位傳導(dǎo)速度(MCV)的影響不同組之間評(píng)分結(jié)果有顯著性差異(F=3.183，P=0.025)，治療前后評(píng)分結(jié)果有顯著差異(F=187.437，P<0.001)；在不同分組之間，生理鹽水組(t=0.708，P=0.502)無顯著性差異，高劑量組(t=9.642，P<0.001)、中劑量組(t=5.170，P=0.001)和低劑量組(t=14.803，P<0.001)結(jié)果均有顯著性差異。從不同組來看，治療

17、前差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.394，P=0.812)，治療后評(píng)分結(jié)果差異有顯著差異(F=9.327，P<0.001)，其中以高劑量組療效最顯著。各組與治療前后之間存在交互效應(yīng)(F=16.372，P<0.001)，由表可知，治療后傳導(dǎo)速度最大值在頸復(fù)康組，最小值在治療后生理鹽水組； 四、結(jié)論： 1.葛根提取物對(duì)神經(jīng)根型頸椎病神經(jīng)根性疼痛大鼠有較好的止痛作用，當(dāng)葛根提取物中含葛根素劑量為266.1、133.0、66.5mg