抗癲癎藥物對大鼠認(rèn)知功能的影響及與海馬神經(jīng)元凋亡關(guān)系的研究.pdf

1、癲癇(Epilepsy，EP)是多種病因引起的綜合征，是神經(jīng)系統(tǒng)常見病、多發(fā)病之一。癲癇主要靠藥物治療，抗癲癇藥物對認(rèn)知功能的影響目前倍受重視，為進(jìn)一步了解抗癲癇藥物對認(rèn)知功能影響的程度和造成損害的原因，進(jìn)行下述系列研究。 目的 確定常用抗癲癇藥物對認(rèn)知功能的影響；了解抗癲癇藥物是否造成海馬神經(jīng)元的凋亡；探討海馬神經(jīng)元凋亡基因表達(dá)的變化。 方法 1 藥物：選用常用的苯妥英鈉、丙戊酸鈉、卡馬西平、托吡酯、拉

2、莫三嗪五種藥物。 2 動物：選擇60天齡健康雄性SD(Sprague-Dawley)大鼠為研究對象，共105只，隨機(jī)分為7個(gè)組，每組15只。 3 癲癇動物模型的制備：將上述7組SD大鼠隨機(jī)分為正常對照組(NS組)、癲癇未治療組(PTZ組、)、丙戊酸鈉治療組、苯妥英鈉治療組、卡馬西平治療組、托吡酯治療組及拉莫三嗪治療組。正常對照組每天腹腔注射生理鹽水，其余6組每天腹腔注射戊四氮3.5mg/kg點(diǎn)燃。 4 動物點(diǎn)燃后

3、的處理：6組SD大鼠點(diǎn)燃后，隨機(jī)分為不干預(yù)和5種藥物處理組。此后每天腹腔注射PTZ，但5個(gè)藥物處理組在每天注射PTZ后30分鐘經(jīng)口腔灌注不同的AEDs，劑量為人均量/kg的25倍。PTZ組30分鐘后灌注生理鹽水。NS組每天注射與PTZ組等量的生理鹽水，灌注生理鹽水。持續(xù)3周。 5 認(rèn)知功能檢測：3周后讓所有大鼠分別進(jìn)行水迷宮測試，記錄每只大鼠成功次數(shù)、游完6次×4天次所用的時(shí)間，以NS組和PTZ組為對照，觀察有無差異。

4、6 TLJNEL法原位標(biāo)記DNA片段檢測凋亡的神經(jīng)元 6.1 腦組織標(biāo)本切片的制作方法：①每組各隨機(jī)選取大鼠5只，用10％水合氯醛(0.36ml/100g)腹腔注射麻醉，剪開胸腔，從心尖處插入圓頭針，同時(shí)從右心耳處剪開心臟放血。大鼠在同時(shí)間點(diǎn)先后灌注0.9％生理鹽水200ml沖洗和4％多聚甲醛磷酸緩沖液250ml固定。灌注完畢后立即斷頭，迅速取出雙側(cè)海馬，4％的多聚甲醛固定，常規(guī)梯度乙醇脫水，二甲苯透明，浸臘，包埋，選取海馬、齒

5、狀回互包平面行連續(xù)冠狀切片，片厚5μm，選取CA1、CA3區(qū)連續(xù)切片備用。②石蠟包埋的切片再經(jīng)脫蠟至水，用蛋白酶K液37℃孵育30min，PBS沖洗2次；滴加50μl的TUNEL 反應(yīng)混合液，在濕盒中37℃孵育60min，PBS沖洗3次。DAB暗環(huán)境下顯色。③切片經(jīng)過梯度酒精脫水干燥，二甲苯透明，中性樹膠封固。 6.2 TUNEL法檢測陽性表達(dá)細(xì)胞：在光鏡下觀察海馬CA1、CA3區(qū)及齒狀回神經(jīng)元，400倍下選擇5個(gè)具有代表性的視

6、野，計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞數(shù)和陰性細(xì)胞數(shù)，并計(jì)算陽性表達(dá)百分率[陽性表達(dá)百分率=陽性細(xì)胞數(shù)/(陽性細(xì)胞數(shù)+陰性細(xì)胞數(shù))×100％]，計(jì)算平均值。 7 流式細(xì)胞學(xué)分析 7.1 取材：隨機(jī)取每組大鼠各5只，快速斷頭取腦，預(yù)冷三蒸水洗去血漬，去除腦外膜。 8 sqR7F-PCR分析bcl-2，bax表達(dá)量目的基因引物的合成：引物序列依據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道設(shè)計(jì)，由上海生物工程公司合成。 9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS 11.0軟件進(jìn)行統(tǒng)

7、計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，采用x<'2>檢驗(yàn)、方差分析(ANOVA，F(xiàn)檢驗(yàn))、q檢驗(yàn)(New-man-Keuls法)比較。陽性率的比較采用x<'2>檢驗(yàn)。α=0.05，P<0.05 認(rèn)為差異有顯著性，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果 1 認(rèn)知功能 1.1 各組完成每次測試所用時(shí)間均數(shù)差異的兩兩比較在不同的次別中，托吡酯組與其他6組之間均數(shù)差異有顯著性(P<0.05)，托吡酯組耗時(shí)在某次高于其他1組或所有組。

8、其余各組差異無顯著性(P>0.05)。 1.2 各組每天測試所用時(shí)間均數(shù)差異的兩兩比較第1天，托吡酯組高于拉莫三嗪組，均數(shù)存在差異(P<0.05)。第2天，托毗酯組高于丙戊酸鈉組、拉莫三嗪組，均數(shù)存在差異(P<0.05)。第3天，托吡酯組高于PTZ組、拉莫三嗪組，均數(shù)存在差異(P<0.05)。第4天，托吡酯組高于卡馬西平組、丙戊酸鈉組、拉莫三嗪組，均數(shù)存在差異(P<0.05)。其余各組差異無顯著性(P>0.05)。 1.

9、3 各組完6次測試時(shí)間總均數(shù)差異的兩兩比較托吡酯組用時(shí)長于其他6組(P<0.01)。拉莫三嗪組短于其他6組(與丙戊酸鈉組、卡馬西平組比較，P<0.05；與其他組比較，P<0.01)。苯妥英鈉組長于NS組、丙戊酸鈉組、卡馬西平組(P<0.05)和拉莫三嗪組(P<0.01)；短于托吡酯組(P<0.0 1)。其余各組間差異無顯著性(P>0.05)。 1.4 短期學(xué)習(xí)與記憶功能測試成績提高狀況苯妥英鈉組成績提高較慢，第1次與第4、6次之

10、間存在差異(P<0.05)。托吡酯組很慢，各次之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。其余各組成績提高均快(P<0.05，P<0.01)。 1.5 中期學(xué)習(xí)與記憶功能測試成績提高狀況托吡酯組：4天之間差異無顯著性(P>0.05)。拉莫三嗪組：第1天與第2天(P<0.05)、第3、4天(P<0.01)以及第2天與第3、4天(P<0.05)之間差異有顯著性。其余各組介于此兩組之間(P<0.05，P<0.01)。 1.6 各組之

11、間定向?qū)ふ移脚_象限時(shí)間的比較托吡酯組所需時(shí)間明顯多于其他6組(P<0.01)。其余各組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。 1.7 各組之間定向逗留平臺象限時(shí)間的比較托毗酯組與卡馬西平組(P<0.05)、拉莫三嗪組(P<0.01)均數(shù)存在差異。其余各組差異無顯著性(P>0.05)。 1.8 測試成績提高狀況PTZ組學(xué)習(xí)成績提高快(P<0.05，P<0.01)?？R西平組、丙戊酸鈉組、拉莫三嗪組測試成績提高很快(P<0.01

12、)，優(yōu)于NS組。苯妥英鈉組測試成績提高較慢(P<0.05)，與NS組比較無明顯差異。托吡酯組測試成績提高慢，各次、各天之間差異無顯著性(P>0.05)，較NS組差。 2 TUNEL 結(jié)果 2.1 PTZ及抗癲癇藥物對大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元TUNEL陽性表達(dá)的影響生理鹽水組陽性率2.79％，PTZ組陽性率3.72％，卡馬西平組陽性率5.70％，丙戊酸鈉組陽性率 3.56％，4組之間差異無顯著性(X<'2>=3.59，P>0

13、.05)。苯妥英鈉組陽性率33.68％，托吡酯組陽性率35.79％，拉莫三嗪組陽性率34.02％，三組之間差異無顯著性(X<'2>=0.32，P>0.05)。生理鹽水組、PTZ組、卡馬西平組、丙戊酸鈉組與苯妥英鈉組、托吡酯組、拉莫三嗪細(xì)．之間差異有顯著性(X<'2>=329，P<0.005)。 2.2 PTZ及抗癲癇藥物對大鼠海馬CA3區(qū)神經(jīng)元TUNEL陽性表達(dá)的影響。 3 FCM結(jié)果3.1 PTZ及抗癲癇藥物對大鼠海馬

14、神經(jīng)元Bcl-2表達(dá)的影響。 4 RT-PCR結(jié)果。 結(jié)論 1 抗癲癇藥物對認(rèn)知功能有一定影響，有些提高認(rèn)知功能，有些損害認(rèn)知功能。托吡酯、苯妥英鈉損害認(rèn)知功能，托吡酯還可損害大鼠的記憶功能，降低大鼠的反應(yīng)狀態(tài)。丙戊酸鈉、卡馬西平、拉莫三嗪對大鼠學(xué)習(xí)記憶功能有改善作用，反應(yīng)良好。PTZ對大鼠認(rèn)知功能無不良影響。 2 癲癇經(jīng)苯妥英鈉、托吡酯及拉莫三嗪藥物治療后，海馬區(qū)存在 TUNEL染色陽性細(xì)胞；TUNEL

15、 染色陽性細(xì)胞大部分是神經(jīng)元，一部分是神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。PTZ點(diǎn)燃組、生理鹽水對照組、卡馬西平組及丙戊酸鈉組海馬區(qū)神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞TUNEL 陽性表達(dá)率很低，4組相比差異無顯著性(P>0.05)。 3 某些抗癲癇藥物通過影響B(tài)cl-2、Bax 表達(dá)引起海馬神經(jīng)元凋亡。PTZ點(diǎn)燃癲癇發(fā)作經(jīng)苯妥英鈉、卡馬西平、拉莫三嗪治療后海馬神經(jīng)元Bcl-2表達(dá)上調(diào)，與生理鹽水對照組相比，差異有顯著性(P<0.05)。Bax表達(dá)下調(diào)，與生理鹽水對

16、照組相比，差異無顯著性(P>0.05)。Bcl-2/Bax 比值高于生理鹽水對照組，差異有顯著性(P<0.05)。 PTz點(diǎn)燃癲癇發(fā)作經(jīng)丙戊酸鈉、托吡酯治療后海馬神經(jīng)元Bcl-2表達(dá)上調(diào)，與生理鹽水對照組相比，差異無顯著性(P>0.05)。Bax表達(dá)下調(diào)，與生理鹽水對照組相比，差異無顯著性(P>0.05)。Bcl-2/Bax比值與生理鹽水對照組相比，差異無顯著性(P>0.05)。 4 PTZ 點(diǎn)燃癲癇發(fā)作經(jīng)治療后各組海馬

17、神經(jīng)元bcl-2 表達(dá)增加及bcl-2/β-actin比值增大，但與生理鹽水組相比，差異無顯著性(P>0.05)。各組之間bcl-2/bax比值差異無顯著性(P>0.05)。海馬神經(jīng)元bax表達(dá)有差異，丙戊酸鈉組與生理鹽水對照組相比降低差異有顯著性(P<0.05)。各組bax/β-actin表達(dá)有差異，苯妥英鈉組、丙戊酸鈉組與生理鹽水對照組相比降低差異有顯著性(P<0.05)。其余各組之間差異無顯著性(P>0.05)。海馬神經(jīng)元bcl-