

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1、目的:癲癇(Epilepsy,EP)是由多種因素引起的慢性腦功能障礙綜合征,是神經(jīng)系統(tǒng)常見(jiàn)病。目前癲癇的治療主要依靠抗癲癇藥物。隨著對(duì)癲癇研究的不斷深入,癲癇對(duì)認(rèn)知功能的影響逐漸受到人們的重視,但其確切機(jī)制尚未闡明。在臨床上很難區(qū)分認(rèn)知功能損害是由癲癇本身引起的,還是應(yīng)用抗癲癇藥物(AEDs)所造成的,而癲癇動(dòng)物模型卻可以通過(guò)控制癲癇發(fā)作的各個(gè)因素來(lái)探討癲癇對(duì)認(rèn)知功能損害的可能原因和相關(guān)機(jī)制。我們利用戊四氮(Pentetrazole,P
2、TZ)點(diǎn)燃的慢性癲癇大鼠模型,通過(guò)丙戊酸鈉(valproate,VPA)、妥泰(topiramate,TPM)治療使癲癇得到控制后,應(yīng)用Morris水迷宮試驗(yàn)檢測(cè)大鼠經(jīng)抗癲癇藥物治療后認(rèn)知功能的差異,以評(píng)價(jià)大鼠的行為學(xué)改變,用DNA原位末端標(biāo)記法(terminaldeoxynucleotidyl transferse-mediated biotinylated deoxyuridinetriphosphate nickel end la
3、beling,TUNEL)檢測(cè)海馬區(qū)的凋亡細(xì)胞,應(yīng)用免疫組化法檢測(cè)海馬區(qū)神經(jīng)元Bax和Bcl-2的表達(dá)的變化,以研究評(píng)價(jià)抗癲癇藥物丙戊酸鈉、妥泰對(duì)癲癇大鼠認(rèn)知功能的影響。 方法: 1、分組 選用清潔級(jí)健康雄性青春期Sprague-Dawley(SD)大鼠40只(201±29)g,隨機(jī)分為4組,每組lO只。隨機(jī)選取1組作為正常對(duì)照組(NS組),其余3組用戊四氮(PTZ)點(diǎn)燃,致癇后隨機(jī)選取1組作為癲癇對(duì)照組(PT
4、Z組),另外2組(實(shí)驗(yàn)組)給予丙戊酸鈉(VPA組)、妥泰(TPM組)控制癲癇發(fā)作。 2、造模正常對(duì)照組大鼠每日上午腹腔注射生理鹽水(35mg/kg),其余3組按35mg/(kg·d)腹腔注射化學(xué)致癇劑戊四氮,直至達(dá)到足夠強(qiáng)度癲癇發(fā)作,約需持續(xù)2周。 3、腦電圖描記在SD大鼠完全點(diǎn)燃后進(jìn)行腦電圖記錄,檢驗(yàn)點(diǎn)燃效果。將大鼠固定于腦立體定位儀上,參照電極固定于鼻部,前額、顳葉或頂葉各一支電極,地線固定于背部。 4
5、、治療 造模成功后進(jìn)行如下處理:正常對(duì)照組,繼續(xù)腹腔注射生理鹽水(35mg/kg)每日1次;PTZ組繼續(xù)按35mg/(kg·d)腹腔注射PTZ每日1次。正常對(duì)照組、PTZ組經(jīng)口腔用生理鹽水灌胃,每日2次;實(shí)驗(yàn)組將溶于生理鹽水的丙戊酸鈉、妥泰每日分2次分別灌胃,每日總劑量按成人單位體重劑量的25倍計(jì)算,丙戊酸鈉約250mg/(kg·d),妥泰約80mg/(kg ·d)。 5、行為學(xué)檢測(cè)應(yīng)用Morris水迷宮試驗(yàn)檢測(cè)各組
6、大鼠經(jīng)治療后學(xué)習(xí)及記憶功能的差異。 6、海馬神經(jīng)元凋亡的檢測(cè)完成行為學(xué)檢測(cè)后,將各組大鼠在深度麻醉下用生理鹽水、4%多聚甲醛溶液經(jīng)左心室、主動(dòng)脈灌注,取海馬組織,置于4%多聚甲醛溶液中后固定后制作石蠟標(biāo)本。用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的脫氧尿嘧啶核苷三磷酸缺口末端標(biāo)記技術(shù)(terminal deoxynucleotidyl transferse-mediatedbiotinylated deoxyuridine triphosp
7、hate nickel end labelingtechnique.TUNEL)檢測(cè)海馬區(qū)的凋亡細(xì)胞。 7 Bcl-2和Bax陽(yáng)性細(xì)胞的檢測(cè)標(biāo)本制作方法同上,用免疫組化方法檢測(cè)Bcl-2和Bax陽(yáng)性細(xì)胞。 結(jié)果: 1、造模情況 實(shí)驗(yàn)組大鼠按35mg/(kg·d)腹腔注射致癇劑PTZ,持續(xù)2周,均達(dá)到足夠強(qiáng)度癲癇發(fā)作,造模成功。 2、腦電圖結(jié)果正常對(duì)照組表現(xiàn)為以9-11Hz α波為主,散在θ波,兩側(cè)對(duì)稱
8、,無(wú)癇樣放電。 PTZ點(diǎn)燃組均出現(xiàn)典型的高波幅棘一慢波、尖一慢波、棘波、尖波發(fā)放。 3、治療結(jié)果 丙戊酸鈉、妥泰治療組均能控制癲癇發(fā)作。 4、行為學(xué)檢測(cè)Morris水迷宮試驗(yàn)測(cè)試結(jié)果顯示: VPA組測(cè)試成績(jī)提高很快(P<0.01)。TPM組測(cè)試成績(jī)提高慢,各次、各天之間差異無(wú)顯著性(P>0.05),較NS組差。每天完成6次測(cè)試所用時(shí)間的比較顯示,TPM組較其他3組所用時(shí)間長(zhǎng)(P<0.01):
9、其他3組所用時(shí)間無(wú)顯著性差異(P>0.05)。在尋找平臺(tái)象限和在平臺(tái)象限逗留時(shí)間的測(cè)試中,TPM組尋找平臺(tái)象限時(shí)間與其他3組之間均數(shù)存在差異(P<0.01),所需時(shí)間明顯長(zhǎng)于其他組;逗留平臺(tái)象限時(shí)間較其他3組無(wú)顯著性差異(P>0.05)。其他3組尋找平臺(tái)象限和在平臺(tái)象限逗留的時(shí)間無(wú)顯著性差異(P>0.05)。 5、海馬神經(jīng)元凋亡的檢測(cè)結(jié)果正常對(duì)照組、PTZ組、VPA組大鼠海馬區(qū)偶見(jiàn)凋亡細(xì)胞; TPM組大鼠海馬區(qū)凋亡細(xì)
10、胞的數(shù)目增多。 6、Bcl-2陽(yáng)性細(xì)胞的檢測(cè)結(jié)果正常對(duì)照組海馬神經(jīng)元Bcl-2陽(yáng)性細(xì)胞為一些弱染的、散在的細(xì)胞; PTZ模型組海馬神經(jīng)元存在較多的Bcl-2陽(yáng)性細(xì)胞,陽(yáng)性細(xì)胞著色和密度均有增強(qiáng); VPA組海馬神經(jīng)元Bcl-2陽(yáng)性細(xì)胞較PTZ組無(wú)明顯變化; TPM組海馬神經(jīng)元Bcl-2陽(yáng)性細(xì)胞較PTZ組減少,陽(yáng)性細(xì)胞著色和密度均減弱,較正常對(duì)照組無(wú)明顯變化。 7、Bax陽(yáng)性細(xì)胞的檢測(cè)結(jié)果正常對(duì)照組
11、海馬神經(jīng)元Bax陽(yáng)性細(xì)胞為一些弱染的、散在的細(xì)胞; PTZ模型組海馬神經(jīng)元存在較密集的Bax陽(yáng)性細(xì)胞分布,陽(yáng)性細(xì)胞著色較深,密度增強(qiáng); VPA組海馬神經(jīng)元Bax陽(yáng)性細(xì)胞較PTZ組減少,陽(yáng)性細(xì)胞著色和密度均減弱,較正常對(duì)照組無(wú)明顯變化; TPM組海馬神經(jīng)元Bax陽(yáng)性細(xì)胞較PTZ組增多,陽(yáng)性細(xì)胞著色和密度均增強(qiáng)。 結(jié)論: 1、成功建立了PTZ點(diǎn)燃的慢性癲癇大鼠模型。 2、Morris水迷宮
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