外周神經(jīng)損傷后TIMPs在大鼠背根神經(jīng)節(jié)中的表達(dá)改變及其意義.pdf

1、背景:
　　 當(dāng)脊柱疾患發(fā)展到后期嚴(yán)重階段，多通過手術(shù)來解除局部壓迫，重建脊柱穩(wěn)定性，從而達(dá)到治療目的。近三十年來，脊柱手術(shù)方式及內(nèi)固定器械已得到極大發(fā)展，進(jìn)行了各種復(fù)雜手術(shù)，也取得了一些令人鼓舞的療效，然而部分患者在術(shù)后一段時(shí)期內(nèi)仍感到嚴(yán)重而持續(xù)的疼痛不適，影響了患者的生活質(zhì)量及對進(jìn)一步治療的信心。既往，我們把這種疼痛產(chǎn)生的原因都?xì)w咎于手術(shù)失敗，但隨著研究的深入，我們發(fā)現(xiàn)部分患者的疼痛表現(xiàn)有著更深層的病理機(jī)制，故稱這種疼痛為神

2、經(jīng)病理性疼痛，其影響全球成千上百萬人，就其本身而言，可認(rèn)為是一種疾病。神經(jīng)病理性疼痛機(jī)制復(fù)雜，目前對其了解尚不深刻，雖然根據(jù)已有的研究成果采取了一些對癥治療措施，但是療效有限。
　　 外周神經(jīng)系統(tǒng)受到損傷可引起神經(jīng)病理性疼痛，損傷形式多樣，包括創(chuàng)傷、疾患、大型手術(shù)、腫瘤甚至是化療等，其疼痛程度不等，可表現(xiàn)為自發(fā)性疼痛或誘發(fā)性疼痛等不同形式。研究發(fā)現(xiàn)，受損神經(jīng)處可形成神經(jīng)瘤，產(chǎn)生明顯的異位放電；受損神經(jīng)處和對應(yīng)的背根神經(jīng)節(jié)中會有明

3、顯的炎性細(xì)胞浸潤；可伴有顯著的基因表達(dá)調(diào)控改變等等。受體和通道性狀的改變在神經(jīng)病理性痛信息傳遞與調(diào)控過程中起至關(guān)重要的作用。實(shí)驗(yàn)顯示，神經(jīng)損傷后P2X3、TRPV和Nav1.8等通道的表達(dá)明顯改變；5HT3a、GFRalpha2和GABAalpha5等受體也有明顯的表達(dá)改變；神經(jīng)元細(xì)胞膜上的Na+-K+泵也有表達(dá)改變。此外，神經(jīng)系統(tǒng)可塑性的改變還包括軸突再生、突觸重塑以及炎性因子、神經(jīng)遞質(zhì)和神經(jīng)生長因子等的上調(diào)或下調(diào)等復(fù)雜因素。

4、　　 目前臨床用于治療神經(jīng)病理性疼痛的藥物有多種，但這些藥物的作用機(jī)理主要是抑制神經(jīng)元靶體、阻斷神經(jīng)傳遞，因此，它們可以抑制疼痛癥狀，但并非是治療神經(jīng)病理性疼痛潛在性的病理過程，治療作用短暫且可產(chǎn)生嚴(yán)重的副作用。
　　 就病理機(jī)制而言，神經(jīng)病理性疼痛被認(rèn)為是神經(jīng)可塑性在外周和中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的一種表達(dá)形式。最近的研究顯示，神經(jīng)系統(tǒng)中的炎癥反應(yīng)在神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生和發(fā)展過程中扮演重要角色。神經(jīng)損傷后，多種炎性細(xì)胞因子，如白細(xì)胞介

5、素(IL)-1β，IL-6和腫瘤壞死因子(TNF)-a等，在神經(jīng)纖維和背根神經(jīng)節(jié)(dorsalrootganglion，DRG)中被誘導(dǎo)表達(dá)，對背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元胞體和軸突高興奮性引起的外周敏化過程起重要作用。炎性細(xì)胞因子通過增強(qiáng)神經(jīng)元的興奮性突觸傳遞，或抑制神經(jīng)元的抑制性突觸傳遞而產(chǎn)生長效作用。
　　 基質(zhì)金屬蛋白酶(matrixmetalloprotease，MMP)是一大類同源蛋白，具有肽鏈內(nèi)切酶活性，可降解細(xì)胞外基質(zhì)的大部

6、分成分，其酶活性的發(fā)揮需要Zn2+及Ca2+的存在，現(xiàn)已有近三十種基質(zhì)金屬蛋白酶被確定。基質(zhì)金屬蛋白酶抑制因子(tissueinhibitorsofmetalloproteinase，TIMP)為其內(nèi)源性抑制物，目前其家族成員共有四種。二者在體內(nèi)可由成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞等多種細(xì)胞合成和分泌，廣泛分布于人體各組織。基質(zhì)金屬蛋白酶通過裂解細(xì)胞外基質(zhì)中的蛋白、細(xì)胞因子和趨化因子，在炎癥反應(yīng)過程中發(fā)揮

7、重要作用。在MMP家族20多名成員中，具有明膠酶活性的MMP-9和MMP-2最為被研究，MMP-9和MMP-2活性分別受TIMP-1和TIMP-2的抑制。
　　 通過實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的脊髓神經(jīng)結(jié)扎(spinalnerveligation，SNL)模型研究，發(fā)現(xiàn)脊髓神經(jīng)結(jié)扎后可在背根神經(jīng)節(jié)中誘導(dǎo)迅速(<1天)而短暫(<3天)的MMP-9表達(dá)上調(diào)，說明在早期階段，MMP-9的抑制或表達(dá)缺失可以減輕神經(jīng)病理性疼痛，作為MMP-9的特異性抑制物

8、，TIMP-1對神經(jīng)病理性疼痛的阻斷作用在早期階段特別有效，但在后期階段則沒有作用；而脊髓神經(jīng)結(jié)扎后在背根神經(jīng)節(jié)中MMP-2的表達(dá)上調(diào)則出現(xiàn)延遲性(>7天)和持久性(>21天)的特點(diǎn)，揭示MMP-2可能觸發(fā)后期階段的神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生，MMP-2的作用可被其特異性抑制物TIMP-2所阻斷。
　　 綜上所述，神經(jīng)病理性疼痛發(fā)生的早期和后期階段分別有MMP-9和MMP-2的參與，對背根神經(jīng)節(jié)中MMP-9或MMP-2的表達(dá)進(jìn)行抑制，

9、也許可為神經(jīng)病理性疼痛的預(yù)防和治療提供一種新的思路。因?yàn)镸MP家族成員眾多，在神經(jīng)病理性疼痛的產(chǎn)生病理機(jī)制中，分別起著不同的生理及病理作用，應(yīng)用廣譜的MMP抑制劑可能不會非常有效，并且會產(chǎn)生嚴(yán)重的副作用。而作為MMP的特異性內(nèi)源性抑制劑，TIMP-1和TIMP-2可通過分別抑制MMP-9和MMP-2的活性，從而顯著減輕疼痛反應(yīng)，故認(rèn)為TIMP及其衍生物在神經(jīng)病理性疼痛的治療上具有一定的潛能。本研究通過建立大鼠外周神經(jīng)損傷模型，研究神經(jīng)損

10、傷對TIMP在背根神經(jīng)節(jié)中的表達(dá)調(diào)控及分布的影響，來更好的理解神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生和發(fā)展過程。
　　 研究目的:
　　 本課題通過檢測正常大鼠背根神經(jīng)節(jié)(DRG)中的基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制因子(TIMP)，明確在生理狀態(tài)下TIMP家族成員是否有表達(dá)，及其表達(dá)分布；通過切除一段大鼠坐骨神經(jīng)建立外周神經(jīng)損傷模型，探討當(dāng)外周神經(jīng)損傷后，TIMP家族成員在大鼠背根神經(jīng)節(jié)中的表達(dá)是否發(fā)生改變，及其變化趨勢。本實(shí)驗(yàn)預(yù)期通過一系列的相

11、關(guān)實(shí)驗(yàn)研究達(dá)到如下目的：
　　 1、有助于形成一套切實(shí)可行的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型及相關(guān)檢測模式，為今后的研究做基礎(chǔ)；
　　 2、檢測在正常生理狀態(tài)下，TIMP在大鼠背根神經(jīng)節(jié)(DRG)中有表達(dá)，不同的TIMP家族成員其表達(dá)分布存在差異；
　　 3、揭示當(dāng)外周神經(jīng)損傷后，TIMP家族成員在大鼠背根神經(jīng)節(jié)(DRG)中表達(dá)或分布的改變趨勢；
　　 4、探討TIMP家族成員在神經(jīng)病理性疼痛病理機(jī)制中的不同作用，以期為神經(jīng)

12、病理性疼痛的治療提供新的思路。
　　 研究方法:
　　 將成年Sprague-Dawley雄性大鼠隨機(jī)分成對照組和實(shí)驗(yàn)組，實(shí)驗(yàn)組按術(shù)后第2天、第70天、第14天及第28天4個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)隨機(jī)分成4組。在實(shí)驗(yàn)組中，結(jié)扎并橫斷大鼠雙側(cè)坐骨神經(jīng)形成動(dòng)物模型，并于術(shù)后分批處死，取L4、L5的背根神經(jīng)節(jié)標(biāo)本待檢測。對照組僅顯露坐骨神經(jīng)，未作其他干預(yù)處理，同法取標(biāo)本待檢測。采用Real-timePCR方法檢測坐骨神經(jīng)橫斷對大鼠背根神經(jīng)

13、節(jié)(DRG)中TIMP-1、TIMP2、TIMP3表達(dá)量的影響，并對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。采用原位雜交(Insituhybridization，ISH)方法顯示外周神經(jīng)橫斷對TIMP-1、TIMP-2、TlMP-3在大鼠背根神經(jīng)節(jié)中的表達(dá)分布的影響。原位雜交實(shí)驗(yàn)結(jié)束后做免疫熒光標(biāo)記，顯示背根神經(jīng)節(jié)中表達(dá)外周蛋白、P2X3、膠原纖維酸性蛋白及轉(zhuǎn)錄活化因子3的細(xì)胞。
　　 結(jié)果:
　　 1、在正常生理狀態(tài)下，TIMP家族成

14、員TIMP-1、TIMP-2、TIMP-3在大鼠背根神經(jīng)節(jié)中均有表達(dá)；TIMP-1mRNA陽性信號見于背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元周圍的衛(wèi)星細(xì)胞中，而非神經(jīng)元中；TIMP-2mRNA陽性信號見于背根神經(jīng)節(jié)初級感覺神經(jīng)元中；TIMP-3mRNA陽性信號見于背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元周圍的衛(wèi)星細(xì)胞中。
　　 2、坐骨神經(jīng)橫斷后，背根神經(jīng)節(jié)中的TIMP-1mRNA表達(dá)水平明顯增加，在術(shù)后第2天達(dá)到峰值，并維持較高水平至術(shù)后第28天(與對照相比)，其差異具有

15、顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；TIMP-1mRNA的表達(dá)上調(diào)不僅見于神經(jīng)元周圍，而且在初級感覺神經(jīng)元中有TIMP-1mRNA的強(qiáng)烈誘導(dǎo)表達(dá)；表達(dá)TIMP-1mRNA的神經(jīng)元主要是中小神經(jīng)元。
　　 3、坐骨神經(jīng)橫斷后，背根神經(jīng)節(jié)中的TIMP-2mRNA的表達(dá)水平于術(shù)后第14天及第28天出現(xiàn)明顯降低(與對照相比)，其差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；正常狀態(tài)下，約80％的神經(jīng)元含有TIMP-2mRNA，而坐骨神經(jīng)橫斷后第14天。TIMP-2mRNA標(biāo)記神

16、經(jīng)元所占比率降至約53％。
　　 4、坐骨神經(jīng)橫斷后，TIMP-3mRNA的表達(dá)水平未發(fā)生明顯變化，仍主要表達(dá)于背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元周圍的衛(wèi)星細(xì)胞中；僅于術(shù)后第2天可見少數(shù)背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元中有TIMP-3mRNA的誘導(dǎo)表達(dá)。
　　 5、坐骨神經(jīng)橫斷后2天，于膠原纖維酸性蛋白(GFAP，顯示衛(wèi)星細(xì)胞活性的一種標(biāo)志物)陽性的衛(wèi)星細(xì)胞中可見TIMP-1mRNA表達(dá)上調(diào)；約70％的TIMP-1mRNA陽性標(biāo)記神經(jīng)元為外周蛋白陽性細(xì)胞

17、，而70％的外周蛋白陽性神經(jīng)元中含有TIMP-1tuRNA。TIMP-1mRNA標(biāo)記神經(jīng)元中僅約46％的神經(jīng)元為P2X3陽性細(xì)胞，而約72％的P2X3陽性神經(jīng)元中含有TIMP-1mRNA。
　　 6、坐骨神經(jīng)橫斷后2天，約94％的TIMP-1mRNA標(biāo)記神經(jīng)元為ATF-3陽性神經(jīng)元，而約89％的ATF3陽性神經(jīng)元為TIMP-1mRNA標(biāo)記神經(jīng)元。
　　 結(jié)論:
　　 TIMP-1作為MMP-9的內(nèi)源性抑制物，可在

18、早期階段逆轉(zhuǎn)機(jī)械性異常疼痛；而TIMP-2作為MMP-2的內(nèi)源性抑制物，則在后期階段有鎮(zhèn)痛作用。本實(shí)驗(yàn)通過檢測在外周神經(jīng)損傷后的不同時(shí)間段，TIMP-1、TIMP-2及TIMP-3在大鼠背根神經(jīng)節(jié)中表達(dá)量及表達(dá)分布的改變，初步闡明了TIMP-1、TIMP-2及TIMP-3的不同表達(dá)模式。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在術(shù)后一天即出現(xiàn)傷害性感受表現(xiàn)，說明在外周神經(jīng)損傷的早期階段，背根神經(jīng)節(jié)中TIMP-1的顯著上調(diào)不能中和MMP-9引起的疼痛效應(yīng)。同時(shí)，神經(jīng)損傷