DC疫苗在hu-SCID小鼠B淋巴瘤及乳腺癌治療中的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、本課題研究目的是建立人源化SCID小鼠(hu-SCID)B淋巴瘤模型，探討DC、CTL、激發(fā)型CD40單克隆抗體5c¨的不同組合對(duì)B淋巴瘤的治療作用：建立hu-SCID乳腺癌模型，探討DC及DC聯(lián)合PDLl單克隆抗體2H1l對(duì)乳腺癌的治療作用，為構(gòu)建B淋巴瘤和乳腺癌的安全有效的DC腫瘤疫苗提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 1.人源化SCID小鼠模型的建立及鑒定。 SCID小鼠連續(xù)4天腹腔注射環(huán)磷酰胺(CTX)抑制骨髓造血，第5天通過腹腔注

2、射移植人外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)。移植4周、8周、12周后分別收集外周血、脾臟、肝臟。熒光顯微鏡下觀察SCID小鼠外周血中人CD3+、CDl9+細(xì)胞；流式細(xì)胞儀測(cè)定小鼠全血中人CD3+、CDl9+細(xì)胞百分率：免疫組織化學(xué)分析SCID小鼠肝臟和脾臟中人CD3+、CDl9+細(xì)胞；ELISA檢測(cè)SCID小鼠血清中人免疫球蛋白IgG含量。結(jié)果顯示：(1)SCID小鼠移植人外周血單個(gè)核細(xì)胞4周、8周、12周后在小鼠外周血中通過熒光顯微鏡下可觀

3、察到人CD3+、CDl9+細(xì)胞，4周后流式細(xì)胞儀測(cè)得小鼠外周血單個(gè)核細(xì)胞中人CDl9+、CD3+細(xì)胞百分率分別為10．6％、31．7％：(2)免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示在小鼠脾臟中存在人CD3+、CDl9+細(xì)胞；(3)移植人外周血單個(gè)核細(xì)胞4周、8周、12周后ELISA測(cè)得小鼠血清中人免疫球蛋白IgG的含量分別為3901xg／ml、n001xg／ml、1040[tg／ml，由此證明，成功地建立了人源化SCID小鼠模型，為實(shí)驗(yàn)奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)。

4、 2．DC疫苗在B淋巴瘤治療中的實(shí)驗(yàn)研究。 在上述工作基礎(chǔ)上，選用人B淋巴瘤細(xì)胞株Daudi在hu-SCID小鼠腹股溝皮下注射，建立hu-SCID的B淋巴瘤模型。接種25天后，分別給予經(jīng)凋亡Daudi細(xì)胞負(fù)載的成熟DC、未成熟DC(imDC)、腫瘤抗原特異性CTL、激發(fā)型CD40單抗5cll聯(lián)合或單獨(dú)治療。imDC+5cil組治愈小鼠3個(gè)月后進(jìn)行腫瘤再負(fù)荷。通過觀察小鼠狀態(tài)、繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線、生存期觀察評(píng)價(jià)療效。ELISA

5、檢測(cè)小鼠血清中IFN．Y濃度；免疫組化分析小鼠腫瘤組織和肝脾組織中活化T細(xì)胞和DC的浸潤(rùn)。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：除5cll組外，各治療組荷瘤小鼠腫瘤體積均有不同程度縮?。桓髦委熃M都有完全緩解(CR)的小鼠，imDC+5cll組CR率達(dá)80％，生存期明顯延長(zhǎng)，3個(gè)月后進(jìn)行的腫瘤再負(fù)荷實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：經(jīng)DC疫苗治療的小鼠對(duì)腫瘤的抵抗能力明顯增強(qiáng)；小鼠血清中在治療后3周仍可測(cè)到IFN．Y。免疫組化顯示，除5cll組外，各治療組荷瘤小鼠腫瘤組織

6、和肝脾組織中均有活化T細(xì)胞和DC的浸潤(rùn)。 3．DC疫苗聯(lián)合PD-L1單抗治療人乳腺癌的作用研究。 業(yè)已表明，腫瘤細(xì)胞表達(dá)的PD-L1在腫瘤逃逸中起著重要的作用。本實(shí)驗(yàn)選用高表達(dá)PD-L1的人乳腺癌細(xì)胞株M231、低表達(dá)PD-L1的人乳腺癌細(xì)胞株M435，構(gòu)建了轉(zhuǎn)基因細(xì)胞M435-PDLl，繼而將激發(fā)型CD3單抗、T細(xì)胞與乳腺癌細(xì)胞株共培育，同時(shí)加入抗人PD-L1單抗2H11，采用3H-TdR測(cè)定T細(xì)胞的增殖和流式細(xì)胞儀測(cè)

7、定T細(xì)胞胞漿內(nèi)IFN．Y。結(jié)果顯示：2H11能阻斷腫瘤細(xì)胞和活化T細(xì)胞間PDLl．PDl途徑，促進(jìn)T細(xì)胞增殖及IFN．Y分泌。 選用人乳腺癌細(xì)胞株M231、M435，常規(guī)方法建立轉(zhuǎn)基因細(xì)胞株M435-PDLl在hu-SCID小鼠腹股溝皮下注射，建立hu-SCID的乳腺癌模型。接種3周后，分別給予經(jīng)凋亡細(xì)胞負(fù)載的成熟DC、成熟DC(imDC)聯(lián)合2H1l治療。通過觀察小鼠狀態(tài)、繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線、生存期觀察評(píng)價(jià)療效。ELISA檢測(cè)小

8、鼠血清中IFN—Y濃度；免疫組化分析小鼠腫瘤組織和肝脾組織中活化T細(xì)胞和DC的浸潤(rùn)。 結(jié)果顯示：經(jīng)DC、DC聯(lián)合2H1l治療的小鼠腫瘤縮小，生存期延長(zhǎng)，DC聯(lián)合2H1l組治療效果優(yōu)于DC組。治療后小鼠血清中均檢測(cè)到IFN-y，腫瘤組織和肝脾組織中有活化T細(xì)胞和DC浸潤(rùn)。 綜上所述，本研究建立了人源化SCID小鼠模型，并對(duì)人源化SCID小鼠B淋巴瘤模型和乳腺癌模型進(jìn)行DC腫瘤疫苗的治療。imDC+5cll治療B淋巴瘤效果由