人工合成寡糖促進乙型肝炎病毒抗原誘導免疫應(yīng)答的研究.pdf

1、乙型肝炎病毒(Heptitis B virus，HBV)屬于嗜肝DNA病毒科，具有嚴格宿主特異性。HBV感染引起的乙型肝炎是嚴重危害人類健康的傳染病，可引起急性或慢性肝炎，并且與原發(fā)性肝細胞癌的發(fā)生密切相關(guān)。盡管乙型肝炎病毒疫苗和藥物在臨床上廣泛應(yīng)用以及新的疫苗和藥物的深入研究，但是乙型肝炎病毒感染仍然是全球范圍內(nèi)影響人類健康的重要因素，據(jù)世界衛(wèi)生組織報告目前在全球范圍內(nèi)約有4億的人群是乙型肝炎病毒的攜帶者，而且每年仍然有5千萬的人群感

2、染HBV。因此開發(fā)新的HBV預(yù)防和治療性疫苗顯得尤為重要，本文主要在此背景下研究人工合成寡糖(在本文中命名為β寡糖)作為佐劑對乙肝疫苗誘導免疫應(yīng)答的影響。 乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)作為疫苗在臨床上被廣泛應(yīng)用于預(yù)防HBV感染，能產(chǎn)生高親和力的中和抗體，與病毒相互作用產(chǎn)生有效的免疫應(yīng)答，達到預(yù)防HBV感染目的。雖然HBsAg被認為是目前有效的HBV預(yù)防疫苗，但是在疫苗接種人群中仍有10％左右的接種者不能產(chǎn)生高滴度的保護性抗

3、體，從而導致疫苗接種失敗。DNA疫苗能誘生較強的特異性CD8<'+>T細胞應(yīng)答成為人們研究預(yù)防和治療性疫苗的熱點，但在大型哺乳動物和人類中所誘導的免疫應(yīng)答強度相對較低。雖然臨床應(yīng)用中DNA疫苗誘導的T細胞免疫原性較弱，但是DNA疫苗的研究和開發(fā)還是具有廣闊的前景。鑒于目前的乙肝疫苗還存在免疫原性弱的問題，而且慢性乙肝的一個原因是機體的免疫應(yīng)答較弱，因此，尋找一種有效的免疫佐劑來增強HBsAg蛋白疫苗和乙肝病毒DNA疫苗誘導的免疫應(yīng)答或改

4、變免疫應(yīng)答類型是開發(fā)HBV疫苗的策略之一。 蘑菇和靈芝等在中國傳統(tǒng)醫(yī)學中被用于疾病的預(yù)防和治療，而且天然的靈芝和蘑菇在中國的食品和藥品領(lǐng)域也具有悠久的歷史。目前研究發(fā)現(xiàn)從不同機體如細菌，真菌，植物和其他的有機體提取的多糖具有良好的免疫調(diào)節(jié)效應(yīng)，可與宿主細胞如巨噬細胞和樹突狀細胞表面的選擇性受體(如dectin-1)相互作用，從而激活巨噬細胞和樹突狀細胞的功能產(chǎn)生相應(yīng)的免疫應(yīng)答。在香菇和靈芝等的提取物中發(fā)現(xiàn)了很多活性物質(zhì)，香菇多糖

5、就是其中一種重要的生物活性物質(zhì)，具有免疫調(diào)節(jié)活性和抗腫瘤活性，能夠調(diào)節(jié)巨噬細胞和樹突狀細胞的功能，通過上調(diào)巨噬細胞和樹突狀細胞MHC分子和協(xié)同刺激分子的表達，增強巨噬細胞和樹突狀細胞的成熟和活化從而發(fā)揮抗原遞呈功能，同時也能夠促進巨噬細胞和DC分泌細胞因子，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用和抗腫瘤作用。多糖和寡糖抗炎癥反應(yīng)和自身免疫性疾病方面也有很多的報道，研究發(fā)現(xiàn)多糖具有抗炎作用，可抑制炎癥因子表達，促進抗炎因子表達等，并且能夠保護機體免受免疫反應(yīng)產(chǎn)

6、生的損傷。鑒于多糖和寡糖的廣泛生物學功能和免疫調(diào)節(jié)作用，其在藥物設(shè)計和疫苗研究方面得以深入研究，發(fā)現(xiàn)多糖結(jié)合疫苗以及多糖佐劑具有良好的調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答效果，多糖增強乙肝病毒DNA疫苗誘導的免疫效應(yīng)以及增強結(jié)核疫苗抗結(jié)核分支桿菌感染的作用。大部分多糖是一種非T細胞依賴的抗原，誘導不依賴T細胞的免疫應(yīng)答，目前發(fā)現(xiàn)兩性多糖也可通過T細胞依賴的方式誘導機體免疫應(yīng)答，因此多糖或寡糖是一個良好的藥物和疫苗佐劑的候選者。 目前報道發(fā)現(xiàn)香菇多糖發(fā)揮

7、抗腫瘤活性與其結(jié)構(gòu)和分子量相關(guān)，香菇多糖主鏈形成三螺旋構(gòu)象對于其發(fā)揮生物學功能具有重要的作用，以β-(1→6)連接為主鏈，β-(1→3)連接為側(cè)鏈的β寡糖是香菇多糖的基本結(jié)構(gòu)單位之一，被認為是香菇多糖發(fā)揮抗腫瘤作用的重要結(jié)構(gòu)，實驗中發(fā)現(xiàn)人工合成的以β-(1→6)連接為側(cè)鏈，β-(1→3)連接為主鏈的β寡糖及其主鏈含有僅α-(1→3)連接的β寡糖類似物和天然提取的香菇多糖具有相似的抗腫瘤作用，能夠促進脾細胞的增殖和腫瘤壞死因子(TNF-α

8、)的分泌。由于目前應(yīng)用的大部分多糖都是植物或動物以及其他物種的提取物，存在結(jié)構(gòu)不確定性，純度不高以及產(chǎn)量較少的問題，而且實驗發(fā)現(xiàn)合成的多糖基本結(jié)構(gòu)單位和多糖具有相似的生物學效應(yīng)，而且人工合成的寡糖具有結(jié)構(gòu)明確，純度高以及產(chǎn)量高等優(yōu)點，因此人們基于這些多糖的基本結(jié)構(gòu)單位人工合成寡糖并觀察其生物學功能。在本實驗中，顧建新教授課題組基于香菇多糖和其他p多糖的基本結(jié)構(gòu)，人工合成了主鏈包含有一個α-(1→3)連接的，以β-(1→6)連接為側(cè)鏈，β

9、-(1→3)連接為主鏈的六聚體β寡糖，我們通過體外實驗觀察其對巨噬細胞和樹突狀細胞功能的影響以及對炎癥因子表達的影響，并通過體內(nèi)實驗觀察寡糖對乙肝病毒表面抗原蛋白疫苗以及核心抗原DNA疫苗誘導免疫應(yīng)答的佐劑效應(yīng)。 第一章人工合寡糖對骨髓來源樹突狀細胞功能的影響鑒于樹突狀細胞在天然免疫應(yīng)答和獲得性免疫應(yīng)答中的重要作用，本實驗以骨髓來源的DC為細胞模型觀察β寡糖的免疫調(diào)節(jié)作用。分離小鼠骨髓細胞，并在細胞因子IL-4和GM-CSF作用

10、下分化為樹突狀細胞(MDC)，通過體外細胞模型觀察人工合成β寡糖對DC細胞功能的影響。根據(jù)顧建新教授提供的高效液相色譜(HPLC)的數(shù)據(jù)提示β寡糖的純度為98％以上。脂多糖(LPS)ELISA檢測顯示在人工合成的β寡糖中未能檢測到LPS，而且β寡糖在實驗使用濃度時對細胞均無毒性，100μg/ml 濃度時還具有促進細胞增殖的作用。在體外使用不同濃度的β寡糖對MDC進行刺激，發(fā)現(xiàn)β寡糖能夠促進MDC協(xié)同刺激分子如CD40，CD80，CD86

11、等表達，并能夠促進MDC成熟：在100μg/ml β寡糖作用下，CD40，CD80，CD86的表達分別為 50.85％，46.19％和39.87％，而未刺激組分別為42.85％，39.78％和27.81％，在200μg/ml β寡糖作用下還能促進MHC Ⅱ類分子表達(處理組 46.01％和未處理組42.87％)，而且CD11c<'+>CD40<'+>或CD11c<'+>CD80<'+>或CD11c<'+>CD86<'+>或CD11c<'

12、+>MHC Ⅱ<'+>細胞的數(shù)量與未處理組相比也有10％-16％不同程度的升高：并且β寡糖對HBsAg誘導的MDC的成熟也有促進作用(12％-26％的升高)，但是對MDC的吞噬能力并沒有影響。成熟的DC能夠遷移到局部淋巴組織誘導T細胞活化，實驗進一步將β寡糖刺激后的MDC用PE-標記的CD11c抗體染色，然后將標記的細胞注射到小鼠右側(cè)腹部皮下，24小時后檢測遷移到淋巴結(jié)中標記的MDC：結(jié)果顯示，右側(cè)腹股溝淋巴結(jié)中有2.07％為遷移的MD

13、C，但在其他部位的淋巴結(jié)中未能檢測到標記的MDC。通過細胞內(nèi)細胞因子染色方法檢測發(fā)現(xiàn)β寡糖對MDC分泌細胞因子IL-10的能力無明顯影響。成熟的 DC可促進初始T淋巴細胞的增殖，通過混合淋巴細胞反應(yīng)檢測發(fā)現(xiàn)β寡糖能促進HBsAg誘導的MDC混合淋巴細胞增殖能力。實驗結(jié)果說明β寡糖能夠增強骨髓來源DC的功能。 第二章人工合成寡糖對小鼠巨噬細胞RAW264.7細胞功能的影響由于巨噬細胞是天然免疫應(yīng)答中的重要成員，在天然免疫應(yīng)答中起著

14、重要的免疫防御和免疫自穩(wěn)作用，而且也是重要的抗原遞呈細胞，因此實驗檢測人工合成的β寡糖對巨噬細胞RAW264.7功能的影響。通過體外用β寡糖和 RAW264.7細胞共培養(yǎng)，48h以后發(fā)現(xiàn)β寡糖可促進RAW264．7細胞增殖，而且能促進RAW264．7細胞表面協(xié)同刺激分子CD40的表達，β寡糖處理組3×10<'4>個細胞中有8,092個細胞表達CD40，而未處理組只有6，168個細胞表達CD40分子，β寡糖能降低CD86和MHC Ⅰ類分子

15、表達，但是對其他表面分子如CD80和MHC Ⅱ類分子的表達并無影響?；罨木奘杉毎哂泻軓娡淌赡芰?，通過中性紅實驗以及對HRP吞噬實驗發(fā)現(xiàn)β寡糖能夠促進巨噬細胞RAW264．7對中性紅和HRP的吞噬作用，未處理組細胞中性紅吞噬率為317％，而聯(lián)合使用β寡糖后的吞噬率為637％，是未處理組的2倍。β寡糖處理后的RAW264．7細胞HRP吞噬率為40．02，而未處理組則為30．71，β寡糖處理后明顯增強RAW264．7細胞的吞噬能力。通過檢

16、測β寡糖處理后對細胞因子TNF-α分泌的影響。 第三章人工合成寡糖對人外周血單核細胞和HT29細胞分泌IL-18及相關(guān)因子的影響IL-18是IL1細胞因子超家族中的一員，是 IFN-γ產(chǎn)生的主要誘導因子之一，在調(diào)節(jié)機體免疫反應(yīng)中起著重要作用，可調(diào)節(jié)天然免疫應(yīng)答和獲得性免疫應(yīng)答，而且也是一種能夠在不同的免疫環(huán)境中調(diào)節(jié)Th1或Th2類免疫應(yīng)答的細胞因子。 第四章人工合成寡糖對乙肝病毒表面抗原誘導免疫應(yīng)答的影響由于β寡糖能增強

17、巨噬細胞和樹突狀細胞功能，因此我們進一步檢測β寡糖對乙肝病毒表面抗原蛋白疫苗誘導免疫應(yīng)答的佐劑效應(yīng)。通過將β寡糖和HBsAg聯(lián)合免疫小鼠，不同時間點觀察β寡糖對HBsAg誘導小鼠免疫應(yīng)答的影響，實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，β寡糖在初次免疫后第6天和第35天可增強HBsAg免疫后小鼠脾臟中巨噬細胞和樹突狀細胞的募集，在第6天HBsAg免疫后小鼠脾臟中巨噬細胞數(shù)量是PBS組的5倍，在第35天則達到8倍左右，而聯(lián)合β寡糖免疫在第6天和第35天分別是PBS組