Nogo受體拮抗劑與甲基強(qiáng)的松龍聯(lián)合治療對脊髓損傷修復(fù)的影響.pdf

1、本文主要從以下幾個部分展開：
　　 第一部分大鼠急性脊髓損傷動物模型的建立及脊髓組織病理的觀察
　　 目的：建立大鼠脊髓背側(cè)半橫斷模型，觀察性別差異對脊髓損傷(Spinalcord injury,SCI)后肢自發(fā)性功能恢復(fù)及脊髓組織病理變化的影響。方法：健康Wistar大鼠40只按性別隨機(jī)分兩組，構(gòu)建大鼠胸髓(T9)背側(cè)半橫斷模型，觀察后肢自發(fā)性功能恢復(fù)的規(guī)律和特點。術(shù)后12h、ld、3d、7d處死動物，取出脊髓組織，用

2、HE染色法觀察脊髓的一般組織病理學(xué)變化。結(jié)果：大鼠胸髓背側(cè)半橫斷后，損傷脊髓有明顯出血、水腫、變性、空泡等，雌、雄大鼠后肢自發(fā)性功能恢復(fù)BBB評分上無統(tǒng)計學(xué)差異，所有動物的后肢運動BBB評分在各個時間的評分都非常接近，在術(shù)后4周達(dá)到了8分左右，并且在以后的時間里維持在8分的水平不再增加。但術(shù)后死亡率、泌尿系統(tǒng)的并發(fā)癥，雌性大鼠明顯少于雄性大鼠，且易于術(shù)后護(hù)理。結(jié)論：結(jié)合脊髓的一般組織病理學(xué)變化規(guī)律，SCI動物模型建立成功，可應(yīng)用于SCI

3、的實驗研究。大鼠術(shù)后自發(fā)性后肢運動功能恢復(fù)與性別無關(guān)，因術(shù)后雌性大鼠護(hù)理上優(yōu)于雄性大鼠，故建議應(yīng)用雌性大鼠構(gòu)建SCI模型。
　　 第二部分Nogo受體(NgR)在大鼠脊髓組織中的表達(dá)及意義
　　 目的：探討SCI后髓鞘相關(guān)抑制分子Nogo受體NgRmRNA和蛋白表達(dá)的變化規(guī)律及意義，并探討Nogo受體拮抗劑(NEPl-40)應(yīng)用于SCI動物模型中的療效。方法：健康Wistar大鼠108只隨機(jī)分為假手術(shù)組、創(chuàng)傷對照組、NE

4、Pl-40治療組，建立大鼠胸髓(T9)背側(cè)半橫斷模型。NEPl-40的給藥方法為術(shù)后于硬膜下管給予NEPl-4012.5 ug/(20ul/PBS.d)，連續(xù)28d，對照組給予等量生理鹽水。術(shù)后24h、3d、7d、14d、28d、42d處死動物，取出脊髓組織，逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)的方法檢測NgRmRNA，免疫熒光及Western Blot的方法檢測NgR蛋白表達(dá)，觀察各組SCI后NgR的變化。結(jié)果：假手術(shù)組NgR mRN

5、A及蛋白表達(dá)在各個時間點無顯著變化（P>0.05）。SCI脊髓組織中NgR mRNA表達(dá)量在損傷后24h表達(dá)減少，3d后上升，7d后逐漸上升至正常水平（與假手術(shù)組比較，P>0.05）；至14d達(dá)到高峰并維持于較高水平，至傷后28d緩慢下降（與假手術(shù)組比較，P<0.05）；傷后42d恢復(fù)至傷前水平。SCI脊髓組織中NgR蛋白表達(dá)量在損傷后24h表達(dá)減少，3d后再次下降，7d后逐漸上升至正常水平(與假手術(shù)組比較，P>0.05);至第14天達(dá)

6、到高峰并維持于較高水平，至傷后28d緩慢下降（與假手術(shù)組比較，P<0.05）；傷后42d恢復(fù)至傷前水平。SCI后14d、28d，NEPl-40組NgRmRNA及蛋白較創(chuàng)傷組均明顯減少P<0.05）。結(jié)論：SCI后NgR表達(dá)呈現(xiàn)動態(tài)變化規(guī)律，針對NgR進(jìn)行干預(yù)有望為SCI后的治療找到新的靶點，NEPl-40在神經(jīng)再生過程中可能發(fā)揮著重要作用。
　　 第三部分甲基強(qiáng)的松龍對大鼠脊髓損傷后細(xì)胞凋亡及TNF-α表達(dá)的影響
　　

7、目的：觀察大劑量甲基強(qiáng)的松龍(methylprednisolone，MP)治療對大鼠受損脊髓腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、神經(jīng)細(xì)胞凋亡及凋亡基因表達(dá)的影響。方法：健康雌性Wistar大鼠124只，隨機(jī)分為假手術(shù)組、創(chuàng)傷對照組、MP治療組。建立大鼠胸髓(T9)背側(cè)半橫斷模型。MP的給藥方法為術(shù)后30 min內(nèi)經(jīng)鼠尾靜脈給予MP30mg/kg；對照組給予等量生理鹽水。術(shù)后lh、4h、12h、24h、3d、7d處死動物，取出脊髓組織，TUN

8、EL檢測細(xì)胞凋亡，轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)的方法檢測mRNA，免疫組織化學(xué)及Western Blot的方法檢測蛋白表達(dá)，觀察各組SCI后Bcl-2、Bax和TNF-α的變化。結(jié)果：采用TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡，結(jié)果SC124h時，脊髓組織細(xì)胞凋亡達(dá)高峰，然后逐漸下降，與假手術(shù)組比較，差異顯著(P<0.05），給予MP治療后，凋亡率明顯降低，與創(chuàng)傷對照組比較，差異具有顯著性(P<0.05）。Bcl-2、Bax mRNA及蛋白結(jié)果

9、顯示，在SCI后4h、12h、3d、7d時MP組大鼠Bcl-2/Bax比值高于創(chuàng)傷組P>0.05），在SCI后24h，MP治療組大鼠脊髓組織Bcl-2/Bax比值明顯高于創(chuàng)傷組（P<0.01）。TNF-α mRNA及蛋白結(jié)果顯示在SCI第12h時，SCI組大鼠脊髓組織TNF-α表達(dá)即達(dá)峰值，與假手術(shù)組比較，差異具有顯著性(P<0.05）；隨著損傷時間的延長，TNF-α表達(dá)逐漸降低，至SCI后14d時，趨于正常水平。應(yīng)用MP治療后，治療組

10、大鼠TNF-α表達(dá)水平明顯降低，與創(chuàng)傷對照組比較，差異具有顯著性（P<0.05）。結(jié)論：細(xì)胞凋亡是SCI早期主要的生物學(xué)事件；細(xì)胞凋亡的調(diào)控基因家族Bax/Bcl-2通過調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡參與SCI的發(fā)生發(fā)展；MP可抑制大鼠SCI細(xì)胞的凋亡，并可調(diào)節(jié)TNF-α等炎癥相關(guān)因子含量，從而實現(xiàn)對SCI的影響。
　　 第四部分Nogo受體拮抗劑與甲基強(qiáng)的松龍聯(lián)合治療促進(jìn)大鼠脊髓損傷后軸突再生和功能恢復(fù)
　　 目的：探討NEPl-40與

11、MP聯(lián)合治療對大鼠胸髓背側(cè)半橫斷傷后脊髓再生修復(fù)的影響及可能機(jī)制。方法：健康雌性Wistar大鼠108只，隨機(jī)分為創(chuàng)傷對照組、MP治療組、NEPl-40治療組和聯(lián)合治療組。建立大鼠胸髓(T9)背側(cè)半橫斷模型。MP的給藥方法為術(shù)后30 min內(nèi)經(jīng)鼠尾靜脈給予MP30 mg/kg; NEPl-40的給藥方法為術(shù)后于硬膜下管給予NEPl-4012.5 ug/(20μl/PBS·d)，連續(xù)7d;對照組給予等量生理鹽水。在不同時間點，免疫熒光、逆

12、轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)、Western Blot的方法檢測GAP-43、MBP mRNA; GAP-43、MBP、GFAP蛋白的表達(dá)，分別采用BBB運動學(xué)功能評分、生物素葡聚糖胺(BDA)順行示蹤、透射電鏡觀察等方法，觀察動物的運動功能、脊髓再生的軸突和髓鞘。結(jié)果：SCI后14d、28d，聯(lián)合用藥組較其他各組GAP-43、MBP mRNA及蛋白的表達(dá)明顯增加(P<。05），同時星形膠質(zhì)細(xì)胞(GFAP)活化數(shù)目和活化持續(xù)時間明

13、顯減少(P<0.05）。超微結(jié)構(gòu)顯示聯(lián)合用藥組軸突數(shù)量多于單獨用藥組，且髓鞘的完整性強(qiáng)于單獨用藥組。用藥組SCI區(qū)及其遠(yuǎn)端BDA標(biāo)記的神經(jīng)纖維數(shù)量明顯多于創(chuàng)傷對照組，聯(lián)合治療組最多（P<0.05）。BBB行為學(xué)評分顯示MP組的行為學(xué)評分提高在SCI兩周內(nèi)明顯，而NEPl-40組行為學(xué)評分提高在SCI兩周后明顯，相對于單獨用藥干預(yù)組，聯(lián)合用藥產(chǎn)生更好的功能恢復(fù)與軸突再生(P<0.05）。結(jié)論：本實驗證實MP和NEPl-40聯(lián)合使用后其作用