嗜酸粒細胞性支氣管炎小鼠模型的建立及其蛋白組學研究.pdf

1、研究背景：嗜酸粒細胞性支氣管炎（eosinophilic bronchitis，EB）是以咳嗽為唯一或主要表現(xiàn)，肺通氣功能和氣道反應(yīng)性正常，誘導痰中嗜酸粒細胞（eosinophils，EOS）明顯增多，皮質(zhì)激素治療有效的一類疾病。這一概念自1989年提出以來，引起眾多學者的廣泛關(guān)注。有人認為EB是一種獨立的疾病，有人認為它是哮喘的早期表現(xiàn)，但EB的發(fā)病原因、病理機制還不十分清楚。目前EB的研究主要集中于臨床患者，暫時還沒有一個確切的EB

2、動物模型。鑒于直接進行人體實驗的局限性，有關(guān)病因的確定、發(fā)病機制的探索、治療方法的評價、疾病的轉(zhuǎn)歸和新藥的研發(fā)在很大程度上需要通過動物實驗進行。因此建立EB動物模型對EB的深入研究具有重要意義。由于有大量相關(guān)分子生物學試劑及抗體供選擇，尤其是基因敲除和轉(zhuǎn)基因技術(shù)的廣泛應(yīng)用，小鼠在國內(nèi)外已成為主要的實驗動物。本課題擬采用小鼠作為實驗對象，為進一步研究EB的發(fā)病機制提供來源廣泛、成本低廉、背景簡單、易于重復、可持續(xù)深入研究的EB動物模型。<

3、br>　　 慢性咳嗽是EB患者主要或唯一的臨床癥狀，EB動物模型也應(yīng)具有這一主要特征。由于小鼠生理解剖結(jié)構(gòu)微小，聲音信號極為微弱，小鼠有無咳嗽目前在國際上還存在很大爭議。目前最多使用小鼠咳嗽模型進行研究的日本Junzo Kamei教授，主要通過觀察小鼠腹部急速抽搐運動同時合并異常呼吸波形來進行小鼠咳嗽的判斷。由于沒有咳嗽聲音的檢測，因此說服力較弱，至今未得到國際公認。小鼠咳嗽檢測成為制約小鼠EB模型建立的關(guān)鍵問題。建立基于小鼠咳嗽聲音

4、檢測基礎(chǔ)上的小鼠咳嗽檢測方法，不僅是小鼠EB模型的基礎(chǔ)條件，亦將為小鼠咳嗽模型得到國際公認提供更有說服力的依據(jù)，為咳嗽機理研究和鎮(zhèn)咳藥物的篩選提供更多的選擇方式。
　　 基因是遺傳信息的載體，蛋白質(zhì)是生命功能的直接執(zhí)行者，對蛋白質(zhì)的研究是跨越基因組與臨床應(yīng)用鴻溝的橋梁。近年來蛋白質(zhì)組學技術(shù)在臨床疾病的發(fā)病機制、診斷及治療研究中得到了廣泛應(yīng)用。如果能夠利用比較蛋白組學方法從臨床和動物模型兩個方面研究EB與正常群體和哮喘之間的差異所

5、在，有可能找到EB疾病相關(guān)的生物標志，為其診斷和治療干預提供新的視點。
　　 研究目的：
　　 1、建立小鼠咳嗽檢測方法；
　　 2、建立小鼠EB模型；
　　 3、篩選EB的疾病相關(guān)蛋白。
　　 研究內(nèi)容：
　　 第一部分小鼠咳嗽檢測方法的建立方法：
　　 使用Buxco無創(chuàng)肺功能檢測系統(tǒng)的密閉體描艙和本課題與美國Buxco公司合作開發(fā)的Finepointe（FP）小鼠咳嗽檢測軟件

6、，在小鼠處于自由活動狀態(tài)時，使用100μmol/L辣椒素霧化激發(fā)，在記錄異常呼吸波形的同時，使用微型麥克風監(jiān)聽小鼠聲音的性質(zhì)，使用cooledit聲音軟件進行濾噪分析，逐步改進小鼠咳嗽的檢測方法。使用可待因、辣椒平和辣椒素耗竭方法進行干預，觀察小鼠咳嗽次數(shù)的變化，觀察人工計數(shù)和軟件自動計數(shù)的相關(guān)性和一致性。
　　 結(jié)果：
　　 建立了利用Buxco無創(chuàng)肺功能體描艙，使用FP小鼠咳嗽檢測軟件進行小鼠咳嗽檢測的標準：即在觀察

7、到小鼠咳嗽波形的同時能夠通過微型麥克風監(jiān)聽到清晰咳嗽聲音，此時確定為一次小鼠咳嗽。經(jīng)多種鎮(zhèn)咳藥物干預后，小鼠咳嗽次數(shù)顯著減少。人工計數(shù)和軟件自動計數(shù)的相關(guān)性為0.964，一致性為0.956。
　　 結(jié)論：
　　 1.小鼠咳嗽檢測方法成功建立：該標準通過直接監(jiān)聽小鼠咳嗽聲音并觀察異常呼吸波形變化來確定是否小鼠咳嗽，無需觀察小鼠腹部運動情況和分析聲波變化。方法可信、簡單易行，有利于小鼠咳嗽模型的推廣和應(yīng)用，同時為小鼠EB模型

8、的建立奠定了基礎(chǔ)。
　　 2.小鼠咳嗽檢測軟件開發(fā)取得階段性成果：使用Buxco無創(chuàng)肺功能體描艙，經(jīng)過不斷的改進和完善，開發(fā)的小鼠FP咳嗽檢測軟件具備較高的可信度，可為小鼠咳嗽模型的廣泛應(yīng)用起到推動作用。
　　 第二部分嗜酸粒細胞性支氣管炎小鼠模型的建立
　　 分題1、OVA滴鼻誘發(fā)小鼠無氣道高反應(yīng)性嗜酸粒細胞性氣道炎癥的劑量
　　 探索方法：
　　 SPF級BALB/c雌性小鼠，分為生理鹽水(n

9、ormal saline，NS)組、哮喘 (asthma，AS)組、低、中、高劑量雞卵白蛋白(ovalbumin，OVA)滴鼻模型組(model，M-1、M-2、M-3組)共5組，每組8只。致敏方法：第0、7、14天OVA (10μg)腹腔注射。第21、22、23天，3個模型組和AS組每天使用0.02％、0.04％、0.2％和0.4％OVA50μl滴鼻激發(fā)；NS組在相同時間內(nèi)使用NS進行致敏和激發(fā)。末次激發(fā)24小時 (hour，h) 后

10、應(yīng)用美國Buxco公司的有創(chuàng)氣道阻力與肺順應(yīng)性檢測系統(tǒng)(RC system)測定動物氣道反應(yīng)性、進行支氣管肺泡灌洗觀察氣道炎癥、HE染色觀察氣道周圍炎癥細胞尤其是嗜酸粒細胞的浸潤程度。
　　 結(jié)果：
　　 1.氣道反應(yīng)性檢測：末次激發(fā)24h后，各組基礎(chǔ)肺阻力無顯著差異。在吸入濃度為6.25、12.5、25、50mg/ml的乙酰甲膽堿(methacholine，MCh)時，AS組和NS組比較肺阻力(lung resista

11、nce，RL)顯著增高。在各個MCh濃度激發(fā)點，M-1組小鼠和NS組比較無顯著差異，而在6.25、12.5、25和50 mg/ml MCh激發(fā)點時，AS組小鼠肺阻力顯著高于M-1組小鼠。M-2組小鼠和M-3組小鼠的肺阻力介于NS組和AS組小鼠之間。
　　 2.肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)細胞分類計數(shù)：3個模型組和AS組BALF中巨噬細胞百分率顯著低于NS組，而中性粒細胞、EOS

12、和淋巴細胞百分率顯著高于NS組，其中以EOS比例增高明顯。
　　 3.肺組織病理學檢測：末次激發(fā)24h后，AS組小鼠支氣管周圍可見明顯炎性細胞浸潤，以EOS浸潤為主。各模型組亦出現(xiàn)輕-中度的氣管周圍炎(炎性細胞浸潤，以EOS和淋巴細胞浸潤為主)及水腫。NS組氣道纖毛上皮排列整齊，氣管/血管周圍無炎性細胞的浸潤、無充血水腫。
　　 結(jié)論：
　　 使用10μg OVA腹腔致敏，10μg OVA滴鼻激發(fā)可成功建立無氣道

13、高反應(yīng)性嗜酸粒細胞性氣道炎癥小鼠模型。
　　 分題2、小鼠咳嗽檢測對氣道反應(yīng)性檢測的影響
　　 方法：
　　 48只SPF級雌性BALB/c小鼠，分成兩大部分，第一部分24只小鼠分為NS組、模型-1(M-1)組和AS組，按照分題1實驗流程，常規(guī)造模行有創(chuàng)肺功能檢測氣道反應(yīng)性，以了解模型是否建立成功。OVA末次滴鼻激發(fā)后24h時，NS組小鼠首先使用辣椒素刺激進行咳嗽檢測，隨后立即進行氣道反應(yīng)性檢測，以了解辣椒素刺激

14、對NS組小鼠氣道反應(yīng)性檢測的影響。其余24只實驗小鼠3組，分別為模型-2(M-2)組、模型-3(M-3)組和模型-4(M-4)組。各組小鼠分別在OVA末次滴鼻激發(fā)后6h，12h，24h進行咳嗽檢測，OVA末次滴鼻激發(fā)后24h時進行氣道反應(yīng)性檢測，以了解辣椒素刺激對模型組小鼠氣道反應(yīng)性檢測的影響。
　　 結(jié)論：
　　 模型建立后在各個時間點使用辣椒素刺激進行小鼠咳嗽檢測對其后的小鼠氣道反應(yīng)性檢測無影響。我們選擇在OVA末次

15、滴鼻后6h進行咳嗽檢測，便于小鼠的正常作息及建立小鼠EB模型實驗的時間安排。
　　 分題3、地塞米松對模型小鼠咳嗽和氣道反應(yīng)性的作用
　　 32只SPF級雌性BALB/c小鼠，分為NS組、模型組、AS組和地塞米松組，每組8只。地塞米松組小鼠在模型組基礎(chǔ)上，每次OVA滴鼻激發(fā)前1h及行氣道反應(yīng)性檢測前1h予地塞米松進行干預。各組小鼠在OVA末次滴鼻激發(fā)后6h行咳嗽檢測，末次滴鼻激發(fā)后24h進行有創(chuàng)氣道反應(yīng)性檢測，進行支氣管

16、肺泡灌洗觀察氣道炎癥，HE染色觀察氣道周圍炎癥細胞尤其是EOS的浸潤程度。
　　 結(jié)果：
　　 1.咳嗽檢測：OVA末次滴鼻激發(fā)后6h模型組和AS組小鼠咳嗽次數(shù)顯著高于NS組；經(jīng)地塞米松預處理后小鼠咳嗽次數(shù)較模型組顯著降低；與NS組比較無顯著差異。
　　 2.氣道反應(yīng)性檢測：OVA末次滴鼻激發(fā)后24h，AS組小鼠在MCh為6.25-50mg/ml激發(fā)濃度時與NS組和模型組比較均有顯著差異；在MCh各個激發(fā)濃度下，

17、NS組和模型組比較均無顯著差異；地塞米松組小鼠氣道反應(yīng)性在MCh濃度為12.5mg/ml時較NS組輕度增高，其它各MCh濃度激發(fā)下與模型組和NS組比較均無顯著差異。
　　 3.BALF細胞分類計數(shù)：NS組小鼠肺泡灌洗液中EOS含量很少，不到1％，以Mac為主；經(jīng)OVA激發(fā)后，模型組、AS組EOS和Neu顯著增高，Mac含量顯著下降；地塞米松干預后，EOS和Neu水平較模型組和AS組顯著降低，但不能恢復到正常水平。