中紅側(cè)溝繭蜂化學(xué)感受蛋白鑒定及功能研究.pdf

1、昆蟲是動(dòng)物世界中最多元化的類群，擁有多種多樣的生命形態(tài)，幾乎能夠適應(yīng)各種生態(tài)環(huán)境。為此它們進(jìn)化出了高度敏感的化學(xué)感受器官，這是他們與環(huán)境相互作用和個(gè)體之間交流的核心。在昆蟲中，表達(dá)在嗅覺器官中的氣味結(jié)合蛋白(odorant binding proteins，OBPs)和化學(xué)感受蛋白(chemosensory proteins，CSPs)起著化學(xué)信號(hào)的檢測與運(yùn)輸作用，介導(dǎo)昆蟲的覓食、擇偶、寄主定位等生理行為，它們對于昆蟲適應(yīng)環(huán)境和維持種群

2、結(jié)構(gòu)具有非常重要的生物學(xué)意義。因此，不管是基礎(chǔ)研究還是生產(chǎn)應(yīng)用，了解昆蟲的嗅覺分子基礎(chǔ)都顯得非常重要。中紅側(cè)溝繭蜂Microplitis mediator(Haliday)是一種獨(dú)居性內(nèi)寄生蜂，寄主廣泛，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，廣泛用于棉鈴蟲等棉田害蟲的生物防治。通過分子生物學(xué)的手段研究中紅側(cè)溝繭蜂的嗅覺分子機(jī)制，可為害蟲防治和天敵利用提供新的策略和方法，為生物防治提供新的靶標(biāo)位點(diǎn)。本文通過篩選中紅側(cè)溝繭蜂觸角轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，鑒定出大量在觸角中特異表

3、達(dá)的OBPs基因和CSPs基因，并對CSP2和CSP3蛋白在中紅側(cè)溝繭蜂觸角感器的表達(dá)及氣味結(jié)合功能進(jìn)行了研究。本文主要研究結(jié)果如下:
　　1.通過篩選中紅側(cè)溝繭蜂觸角轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，共鑒定10個(gè)新的OBPs基因（MmedOBP11～20）和2個(gè)新的CSPs基因（MmedCSP2～3）。MmedOBPs和MmedCSPs的序列比對發(fā)現(xiàn)，中紅側(cè)溝繭蜂的OBPs和CSPs的都屬于“Classical”半胱氨酸模式。Motif分析表明中紅側(cè)

4、溝繭蜂的CSPs比OBPs更加保守。系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果表明MmedOBPs和MmedCSPs在進(jìn)化過程中具有明顯的分化現(xiàn)象。
　　2.利用Real-time Quantitative PCR分析了上述基因在中紅側(cè)溝繭蜂成蟲不同組織的表達(dá)特征。結(jié)果顯示MmedOBP14，MmedOBP18，MmedCSP2和MmedCSP3在觸角中特異或高表達(dá)，表明它們可能參與了中紅側(cè)溝繭蜂的嗅覺識(shí)別過程。而其余的基因具有廣泛的表達(dá)特征，推測其可能具

5、有非嗅覺功能。
　　3.免疫組織化學(xué)對MmedCSP2和MmedCSP3蛋白在觸角感器中的表達(dá)分布進(jìn)行研究。結(jié)果顯示，MmedCSP2特異表達(dá)在腔錐形感器中，而MmedCSP3在錐形感器中表達(dá)，表明這兩個(gè)蛋白分別參與了不同化學(xué)感器的化學(xué)識(shí)別過程。
　　4.熒光競爭結(jié)合實(shí)驗(yàn)研究了MmedCSP2和MmedCSP3重組蛋白與102種潛在配體的結(jié)合特異性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，MmedCSP2結(jié)合反-2-己烯醛、檸檬醛、3，4-二甲基苯甲

6、醛、苯甲醛、水楊酸甲酯、戊醛、B-紫羅蘭酮、3-己酮和茉莉酸甲酯;MmedCSP3蛋白結(jié)合TMTT、DMNT、丁酸乙酯、水楊酸甲酯、油酸和棕櫚酸，此外MmedCSP3與3種夜蛾科昆蟲性信息素(Z11-16:OH，Z11-16:Ald，E11-14:Ac)有很強(qiáng)的親和能力，這表明MmedCSP2與MmedCSP3可能在中紅側(cè)溝繭蜂檢測植物揮發(fā)物方面發(fā)揮重要作用，MmedCSP3可能是中紅側(cè)溝繭蜂利用昆蟲揮發(fā)物來定位寄主或配偶的關(guān)鍵蛋白。<

7、br>　　5.同源模建對MmedCSP2和MmedCSP3的三維結(jié)構(gòu)模型進(jìn)行分析。結(jié)果表明MmedCSP2蛋白具有一個(gè)由7個(gè)α-螺旋構(gòu)成的疏水性結(jié)合腔，和兩對二硫鍵，分子對接實(shí)驗(yàn)預(yù)測Ser12，Tyr15，Leu50和Asn53可能是MmedCSP2與配體結(jié)合的關(guān)鍵位點(diǎn)。MmedCSP3蛋白具有較大的疏水結(jié)合腔，由5個(gè)α-螺旋構(gòu)成，同樣有兩對二硫鍵來穩(wěn)定蛋白結(jié)構(gòu)，推測Ala22、Arg25、Gln26、Glu40、Asp41、Trp45