云斑天牛觸角全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)的構(gòu)建及化學(xué)感受蛋白基因的克隆.pdf

1、對(duì)昆蟲(chóng)嗅覺(jué)機(jī)理的深入研究和嗅覺(jué)信號(hào)傳導(dǎo)途徑的完整闡述，是探索害蟲(chóng)專(zhuān)一性防治的基礎(chǔ)。云斑天牛Batocera hotsfieldi（Hope）是我國(guó)一種主要的林木蛀干害蟲(chóng)，嗅覺(jué)在其交配、尋找食物和生存場(chǎng)所等行為過(guò)程中起著重要的作用，深入研究云斑天牛對(duì)環(huán)境化學(xué)因子刺激的感受機(jī)制及化學(xué)感受蛋白，將為云斑天?？沙掷m(xù)治理的提供新的策略。為此，本研究在利用SMART技術(shù)構(gòu)建云斑天牛觸角全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)并結(jié)合批量EST測(cè)序及序列分析的基礎(chǔ)上，運(yùn)用RT

2、-PCR方法克隆獲得化學(xué)感受蛋白目的基因，并利用蛋白質(zhì)凝膠電泳技術(shù)分析了云斑天?；瘜W(xué)感受蛋白在其機(jī)體中的分布。主要研究結(jié)果如下：
　　 1．用CreatorTM SMARTTM cDNA library construction kit構(gòu)建了0.3-0.6kb和0.6-1kb兩個(gè)特定片段大小的云斑天牛觸角的全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)，并對(duì)兩個(gè)文庫(kù)進(jìn)行了質(zhì)量鑒定。結(jié)果顯示0.3-0.6kb云斑天牛觸角全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)的滴度為6.4x105c

3、fu/mL，庫(kù)容量為8.9x105克隆，插入片段大多在0.5-0.75kb之間，平均長(zhǎng)度大于0.5 kb，重組率94.5％；0.6-1kb云斑天牛觸角全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)的滴度為4.1x106cfu/mL，庫(kù)容量為5.8x106克隆，插入片段大多在0.75-1kb之間，平均長(zhǎng)度大于0.7kb，重組率93.2％。文庫(kù)質(zhì)量鑒定結(jié)果表明，兩個(gè)特定片段大小云斑天牛觸角全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)滴度、重組率符合文庫(kù)質(zhì)量要求。
　　 2．通過(guò)對(duì)兩個(gè)云斑天

4、牛觸角的全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)中隨機(jī)挑取部分的單克隆測(cè)序，得到549條序列。用NCBI/GenBank/Blast、DNAMan和Vector NTI等進(jìn)行序列分析，通過(guò)序列分析，獲得了3個(gè)化學(xué)感受蛋白全長(zhǎng)基因的序列。根據(jù)獲得的一個(gè)化學(xué)感受蛋白全長(zhǎng)基因設(shè)計(jì)特異引物，運(yùn)用RT-PCR擴(kuò)增得到393bp化學(xué)感受蛋白基因全長(zhǎng)序列，推導(dǎo)出了131個(gè)氨基酸序列。從序列結(jié)構(gòu)和生化特性來(lái)看，云斑天?；瘜W(xué)感受蛋白基因全長(zhǎng)序列BhoCSP1具有昆蟲(chóng)化學(xué)感受蛋白

5、典型的保守序列和結(jié)構(gòu)域，即N端19個(gè)氨基酸的信號(hào)肽，序列中有4個(gè)保守的半胱氨酸位點(diǎn)。從同源性分析來(lái)看，云斑天牛化學(xué)感受蛋白基因全長(zhǎng)序列BhoCSP1推導(dǎo)的氨基酸序列與目前報(bào)道鞘翅目唯一一種昆蟲(chóng)赤擬谷盜的19種化學(xué)感受蛋白的同源性較高，BhoCSP1與赤擬谷盜的TcaCSP10、TcaCSP12同源性分別為57％、59％。BhoCSP1推導(dǎo)的氨基酸序列與其它30種Endopterygota昆蟲(chóng)化學(xué)感受蛋白序列的同源性也較高，為21％-59