中紅側溝繭蜂觸角化學識別相關基因鑒定及表達特征分析.pdf

1、中紅側溝繭蜂Microplitis mediator(Haliday)屬膜翅目，繭蜂科。該蜂是棉鈴蟲Helicoverpaarmigera(Hübner)和粘蟲Mythimna separata(Walker)主要的寄生性天敵，同時也可寄生夜蛾科其他昆蟲，寄主范圍多達40余種，是控制害蟲種群密度的重要自然因子。目前，在我國已實現(xiàn)該蜂的大量繁殖，并通過人工釋放用于田間棉鈴蟲等重要害蟲的生物防治。研究證明，寄生蜂的化學識別在寄主定位中具有舉

2、足輕重的作用，而寄生蜂在復雜的化學環(huán)境中成功找到合適寄主又是其控制害蟲、繁衍種群的首要條件。針對中紅側溝繭蜂化學識別機制開展深入研究，可以幫助我們通過調(diào)控寄生蜂化學識別行為，提高田間寄生效率，從而使中紅側溝繭蜂在害蟲生物防治中發(fā)揮更大的作用。本文對中紅側溝繭蜂觸角的化學感器類型及結構特征進行研究，通過二代轉錄組測序技術結合生物信息學分析，從該蜂觸角中鑒定了大量參與化學識別的受體基因，并對嗅覺受體(IRs和ORs)及氣味結合蛋白OBPs在

3、觸角中的表達模式進行研究。主要結果如下:
　　中紅側溝繭蜂雌雄蜂觸角分為柄節(jié)、梗節(jié)和鞭節(jié)三部分。鞭節(jié)由16個亞節(jié)組成，雄蟲觸角鞭節(jié)明顯長于雌蟲觸角鞭節(jié)。掃描電鏡結果顯示，觸角表面分布8種不同形態(tài)的感器，包括:毛形感器、刺形感器、板形感器、錐形感器類型Ⅰ、錐形感器類型Ⅱ、錐形感器類型Ⅲ、腔錐形感器和鐘形感器。其中，板形感器和錐形感器類型Ⅱ表面具有微孔，感器腔內(nèi)分布大量神經(jīng)元樹突，為嗅覺感受器;錐形感器類型Ⅰ和類型Ⅲ表面未發(fā)現(xiàn)微孔，頂

4、端具有明顯的孔狀結構，為味覺感受器，其中錐形感器類型Ⅲ僅分布在雌蟲觸角表面。
　　采用Life Technologies公司研發(fā)的Ion ProtonTM基因測序儀對中紅側溝繭蜂觸角轉錄組進行測序，共鑒定60個氣味受體（MmedORs）、6個離子型受體（MmedIRs）和2個味覺受體(MmedGRs)。利用RACE-PCR技術獲得40個ORs、6個IRs和2個GRs的全長序列。RT-PCR結果顯示MmedOR2，MmedOR26,

5、 MmedOR28, MmedOR29, MmedOR31, MmedOR32, MmedOR34, MmedOR36-OR43,MmedOR45,MmedOR46,MmedOR48,MmedOR49,MmedOR50,MmedOR52和MmedOR53在雌蟲和雄蟲觸角中特異性表達，表明這些基因在寄生蜂觸角嗅覺識別中發(fā)揮重要作用。6個IR基因和2個GR基因幾乎在所有檢測組織中均有分布。qRT-PCR結果顯示25個OR基因（MmedOR1

6、5，16,18,20,21,22,23,24,25,29,30,31,33,34,35,36,37,41,43,45,47,48,49，50和52）在雌觸角表達水平高于雄觸角，表明這些基因在雌蜂尋找寄主過程中發(fā)揮重要作用。MmedOR19和MmedOR26在雄觸角的表達高于雌觸角，暗示這兩個基因可能參與雄蜂對雌蜂性信息素的識別。味覺受體MmedGR64f在雌觸角高表達，可能參與雌蜂觸角味覺識別。6個IR基因均在觸角中高表達，MmedIR

7、8a，MmedIR25a.1，MmedIR25a.2，MmedIR64a和Mm edIR76b在雌觸角的表達水平高于雄觸角，表明這5個IR基因可能在雌蜂寄主識別中發(fā)揮重要作用。
　　利用Illumina HiSeq2500對中紅側溝繭觸角轉錄組進行重測序，共鑒定17個IR基因，其中11個為新基因。進化分析表明10個IR基因編碼“antennal IRs”7個IR基因編碼“divergent IRs”?；蚪Y構分析表明，觸角表達的I

8、R25a同源基因，MmedIR25a.1和MmedIR25a.2，為串聯(lián)重復基因。組織及發(fā)育階段特異性檢測(RT-PCR)，發(fā)現(xiàn)IR基因具有廣泛的表達特征，在成蟲不同組織、幼蟲和蛹期均有表達。定量分析(qRT-PCR)結果顯示，多數(shù)IR基因在成蟲觸角表達水平高于身體，表明IR基因家族參與寄生蜂觸角化學識別功能。熒光免疫組織化學方法對IR基因共表達受體MmedIR8a在觸角中的細胞定位進行研究，結果表明MmedIR8a在嗅覺神經(jīng)元的細胞體

9、和樹突膜表達，軸突未發(fā)現(xiàn)表達，此外表達MmedIR8a的神經(jīng)元樹突末端延伸至板形感器內(nèi)部，表明在寄生蜂觸角中IR基因可能分布在板形感器。
　　中紅側溝繭蜂HiSeq2500觸角轉錄組數(shù)據(jù)庫分析，新鑒定107個MmedORs，結合之前實驗結果，表明中紅側溝繭蜂觸角表達169個MmedORs。系統(tǒng)發(fā)育分析將MmedORs劃分為不同亞家族，亞家族中的多數(shù)MmedORs與毀側溝繭蜂的Microplitis demolitor ORs具有高

10、的序列一致性(＞70％)，表明OR基因在兩種寄生蜂中具有保守的功能。對OR“R”亞家族中的6個成員(MmedOR98，124，125，126，131和155)基因結構進行分析，表明這6個OR基因具有相似的基因結構，每個基因均由7個外顯子和6個內(nèi)含子組成，并且相同位置的外顯子大小相似?；蚪M中，這6個OR基因銜接排列，形成了明顯的OR基因簇，并且基因的編碼區(qū)具有相同的轉錄方向，相鄰基因之間具有短的基因間距。RACE-PCR和RT-PCR對

11、OR基因簇成員的轉錄特征進行分析，發(fā)現(xiàn)基因簇成員之間獨立轉錄，此外在基因組中相鄰的MmedOR124和MmedOR98部分轉錄為雙順反子mRNA（bicistronic mRNA，bmRNA）。原位雜結果表明，以上6個OR基因在雌蟲觸角中表達的細胞數(shù)目不同。通過與嗅覺共表達受體Orco的共表達分析，證明MmedOR基因表達的細胞類型為嗅覺神經(jīng)元。雙色熒光原位雜交對MmedOR12和MmedOR98進行共定位研究，發(fā)現(xiàn)盡管這兩個基因通過R

12、T-PCR檢測到共轉錄，然而，在雌蟲觸角神經(jīng)細胞中未發(fā)現(xiàn)兩者共表達，表明在觸角中這兩個基因主要轉錄為獨立的mRNA，并且在不同的神經(jīng)細胞表達。
　　利用原位雜交技術，對中紅側溝繭蜂18個OBP基因在雌雄蜂觸角的表達分布進行研究。雌雄觸角共檢測到11個OBP基因的表達(MmedOBP1～8，14，18和19)。剩余7個基因(MmedOBP11～13，15～17和20)在雌蟲和雄蟲觸角均未檢測到，推測可能由于這些基因表達量較低，超出原

13、位雜交檢測的閾值。對觸角組織切片中OBP探針標記的細胞分布位置進行分析，發(fā)現(xiàn)10個OBP基因探針標記的細胞分布在觸角感器下方。其中，MmedOBP2、MmedOBP6和MmedOBP7分布在雌蜂和雄蜂板形感器下方，MmedOBP14僅在雄蜂板形感器下方表達;MmedOBP18和MmedOBP1分別在雌蜂和雄蜂錐形感器類型Ⅰ和類型Ⅱ下方表達;MmedOBP3在雄蜂錐形感器類型Ⅰ、雌蜂錐形感器類型Ⅰ和類型Ⅲ下方表達;MmedOBP4和Mme