1、中紅側(cè)溝繭蜂Microplitis mediator(Haliday)屬膜翅目,繭蜂科。該蜂是棉鈴蟲(chóng)Helicoverpaarmigera(Hübner)和粘蟲(chóng)Mythimna separata(Walker)主要的寄生性天敵,同時(shí)也可寄生夜蛾科其他昆蟲(chóng),寄主范圍多達(dá)40余種,是控制害蟲(chóng)種群密度的重要自然因子。目前,在我國(guó)已實(shí)現(xiàn)該蜂的大量繁殖,并通過(guò)人工釋放用于田間棉鈴蟲(chóng)等重要害蟲(chóng)的生物防治。研究證明,寄生蜂的化學(xué)識(shí)別在寄主定位中具有舉
2、足輕重的作用,而寄生蜂在復(fù)雜的化學(xué)環(huán)境中成功找到合適寄主又是其控制害蟲(chóng)、繁衍種群的首要條件。針對(duì)中紅側(cè)溝繭蜂化學(xué)識(shí)別機(jī)制開(kāi)展深入研究,可以幫助我們通過(guò)調(diào)控寄生蜂化學(xué)識(shí)別行為,提高田間寄生效率,從而使中紅側(cè)溝繭蜂在害蟲(chóng)生物防治中發(fā)揮更大的作用。本文對(duì)中紅側(cè)溝繭蜂觸角的化學(xué)感器類型及結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行研究,通過(guò)二代轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)結(jié)合生物信息學(xué)分析,從該蜂觸角中鑒定了大量參與化學(xué)識(shí)別的受體基因,并對(duì)嗅覺(jué)受體(IRs和ORs)及氣味結(jié)合蛋白OBPs在
3、觸角中的表達(dá)模式進(jìn)行研究。主要結(jié)果如下:
中紅側(cè)溝繭蜂雌雄蜂觸角分為柄節(jié)、梗節(jié)和鞭節(jié)三部分。鞭節(jié)由16個(gè)亞節(jié)組成,雄蟲(chóng)觸角鞭節(jié)明顯長(zhǎng)于雌蟲(chóng)觸角鞭節(jié)。掃描電鏡結(jié)果顯示,觸角表面分布8種不同形態(tài)的感器,包括:毛形感器、刺形感器、板形感器、錐形感器類型Ⅰ、錐形感器類型Ⅱ、錐形感器類型Ⅲ、腔錐形感器和鐘形感器。其中,板形感器和錐形感器類型Ⅱ表面具有微孔,感器腔內(nèi)分布大量神經(jīng)元樹(shù)突,為嗅覺(jué)感受器;錐形感器類型Ⅰ和類型Ⅲ表面未發(fā)現(xiàn)微孔,頂
4、端具有明顯的孔狀結(jié)構(gòu),為味覺(jué)感受器,其中錐形感器類型Ⅲ僅分布在雌蟲(chóng)觸角表面。
采用Life Technologies公司研發(fā)的Ion ProtonTM基因測(cè)序儀對(duì)中紅側(cè)溝繭蜂觸角轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行測(cè)序,共鑒定60個(gè)氣味受體(MmedORs)、6個(gè)離子型受體(MmedIRs)和2個(gè)味覺(jué)受體(MmedGRs)。利用RACE-PCR技術(shù)獲得40個(gè)ORs、6個(gè)IRs和2個(gè)GRs的全長(zhǎng)序列。RT-PCR結(jié)果顯示MmedOR2,MmedOR26,
5、 MmedOR28, MmedOR29, MmedOR31, MmedOR32, MmedOR34, MmedOR36-OR43,MmedOR45,MmedOR46,MmedOR48,MmedOR49,MmedOR50,MmedOR52和MmedOR53在雌蟲(chóng)和雄蟲(chóng)觸角中特異性表達(dá),表明這些基因在寄生蜂觸角嗅覺(jué)識(shí)別中發(fā)揮重要作用。6個(gè)IR基因和2個(gè)GR基因幾乎在所有檢測(cè)組織中均有分布。qRT-PCR結(jié)果顯示25個(gè)OR基因(MmedOR1
6、5,16,18,20,21,22,23,24,25,29,30,31,33,34,35,36,37,41,43,45,47,48,49,50和52)在雌觸角表達(dá)水平高于雄觸角,表明這些基因在雌蜂尋找寄主過(guò)程中發(fā)揮重要作用。MmedOR19和MmedOR26在雄觸角的表達(dá)高于雌觸角,暗示這兩個(gè)基因可能參與雄蜂對(duì)雌蜂性信息素的識(shí)別。味覺(jué)受體MmedGR64f在雌觸角高表達(dá),可能參與雌蜂觸角味覺(jué)識(shí)別。6個(gè)IR基因均在觸角中高表達(dá),MmedIR
7、8a,MmedIR25a.1,MmedIR25a.2,MmedIR64a和Mm edIR76b在雌觸角的表達(dá)水平高于雄觸角,表明這5個(gè)IR基因可能在雌蜂寄主識(shí)別中發(fā)揮重要作用。
利用Illumina HiSeq2500對(duì)中紅側(cè)溝繭觸角轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行重測(cè)序,共鑒定17個(gè)IR基因,其中11個(gè)為新基因。進(jìn)化分析表明10個(gè)IR基因編碼“antennal IRs”7個(gè)IR基因編碼“divergent IRs”?;蚪Y(jié)構(gòu)分析表明,觸角表達(dá)的I
8、R25a同源基因,MmedIR25a.1和MmedIR25a.2,為串聯(lián)重復(fù)基因。組織及發(fā)育階段特異性檢測(cè)(RT-PCR),發(fā)現(xiàn)IR基因具有廣泛的表達(dá)特征,在成蟲(chóng)不同組織、幼蟲(chóng)和蛹期均有表達(dá)。定量分析(qRT-PCR)結(jié)果顯示,多數(shù)IR基因在成蟲(chóng)觸角表達(dá)水平高于身體,表明IR基因家族參與寄生蜂觸角化學(xué)識(shí)別功能。熒光免疫組織化學(xué)方法對(duì)IR基因共表達(dá)受體MmedIR8a在觸角中的細(xì)胞定位進(jìn)行研究,結(jié)果表明MmedIR8a在嗅覺(jué)神經(jīng)元的細(xì)胞體
9、和樹(shù)突膜表達(dá),軸突未發(fā)現(xiàn)表達(dá),此外表達(dá)MmedIR8a的神經(jīng)元樹(shù)突末端延伸至板形感器內(nèi)部,表明在寄生蜂觸角中IR基因可能分布在板形感器。
中紅側(cè)溝繭蜂HiSeq2500觸角轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)分析,新鑒定107個(gè)MmedORs,結(jié)合之前實(shí)驗(yàn)結(jié)果,表明中紅側(cè)溝繭蜂觸角表達(dá)169個(gè)MmedORs。系統(tǒng)發(fā)育分析將MmedORs劃分為不同亞家族,亞家族中的多數(shù)MmedORs與毀側(cè)溝繭蜂的Microplitis demolitor ORs具有高
10、的序列一致性(>70%),表明OR基因在兩種寄生蜂中具有保守的功能。對(duì)OR“R”亞家族中的6個(gè)成員(MmedOR98,124,125,126,131和155)基因結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析,表明這6個(gè)OR基因具有相似的基因結(jié)構(gòu),每個(gè)基因均由7個(gè)外顯子和6個(gè)內(nèi)含子組成,并且相同位置的外顯子大小相似?;蚪M中,這6個(gè)OR基因銜接排列,形成了明顯的OR基因簇,并且基因的編碼區(qū)具有相同的轉(zhuǎn)錄方向,相鄰基因之間具有短的基因間距。RACE-PCR和RT-PCR對(duì)
11、OR基因簇成員的轉(zhuǎn)錄特征進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)基因簇成員之間獨(dú)立轉(zhuǎn)錄,此外在基因組中相鄰的MmedOR124和MmedOR98部分轉(zhuǎn)錄為雙順?lè)醋觤RNA(bicistronic mRNA,bmRNA)。原位雜結(jié)果表明,以上6個(gè)OR基因在雌蟲(chóng)觸角中表達(dá)的細(xì)胞數(shù)目不同。通過(guò)與嗅覺(jué)共表達(dá)受體Orco的共表達(dá)分析,證明MmedOR基因表達(dá)的細(xì)胞類型為嗅覺(jué)神經(jīng)元。雙色熒光原位雜交對(duì)MmedOR12和MmedOR98進(jìn)行共定位研究,發(fā)現(xiàn)盡管這兩個(gè)基因通過(guò)R
12、T-PCR檢測(cè)到共轉(zhuǎn)錄,然而,在雌蟲(chóng)觸角神經(jīng)細(xì)胞中未發(fā)現(xiàn)兩者共表達(dá),表明在觸角中這兩個(gè)基因主要轉(zhuǎn)錄為獨(dú)立的mRNA,并且在不同的神經(jīng)細(xì)胞表達(dá)。
利用原位雜交技術(shù),對(duì)中紅側(cè)溝繭蜂18個(gè)OBP基因在雌雄蜂觸角的表達(dá)分布進(jìn)行研究。雌雄觸角共檢測(cè)到11個(gè)OBP基因的表達(dá)(MmedOBP1~8,14,18和19)。剩余7個(gè)基因(MmedOBP11~13,15~17和20)在雌蟲(chóng)和雄蟲(chóng)觸角均未檢測(cè)到,推測(cè)可能由于這些基因表達(dá)量較低,超出原
13、位雜交檢測(cè)的閾值。對(duì)觸角組織切片中OBP探針標(biāo)記的細(xì)胞分布位置進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)10個(gè)OBP基因探針標(biāo)記的細(xì)胞分布在觸角感器下方。其中,MmedOBP2、MmedOBP6和MmedOBP7分布在雌蜂和雄蜂板形感器下方,MmedOBP14僅在雄蜂板形感器下方表達(dá);MmedOBP18和MmedOBP1分別在雌蜂和雄蜂錐形感器類型Ⅰ和類型Ⅱ下方表達(dá);MmedOBP3在雄蜂錐形感器類型Ⅰ、雌蜂錐形感器類型Ⅰ和類型Ⅲ下方表達(dá);MmedOBP4和Mme