鹽度誘導(dǎo)太平洋牡蠣和近江牡蠣三倍體的研究.pdf

1、牡蠣是我國重要養(yǎng)殖貝類,年總養(yǎng)殖產(chǎn)量居于貝類之首。三倍體牡蠣由于其育性差、生長快、品質(zhì)好等諸多優(yōu)于二倍體的特性而成為牡蠣養(yǎng)殖業(yè)的重要組成部分,深受消費(fèi)者青睞。目前,三倍體牡蠣的獲得主要有兩種途徑:一是采用理化方法抑制正常受精卵第二極體的排放,一是利用二倍體與四倍體牡蠣雜交產(chǎn)生100％的三倍體。國內(nèi)三倍體牡蠣的生產(chǎn)多采用第一種途徑,利用6-DMAP、溫度休克等理化方法誘導(dǎo)。本研究中我國養(yǎng)殖牡蠣的主要品種——太平洋牡蠣(Crassostre

2、a gigas)和近江牡蠣(Crossostrea ariakensis)為對(duì)象,嘗試通過高鹽或低鹽抑制受精卵第2極體的釋放,誘導(dǎo)牡蠣三倍體。本方法安全無毒、價(jià)格低廉,適用于牡蠣三倍體產(chǎn)業(yè)生產(chǎn),具有廣闊的應(yīng)用前景。
　　研究主要分為以下兩部分:
　　一、高鹽誘導(dǎo)太平洋牡蠣三倍體
　　本研究中,首先通過熒光染色法顯微觀察太平洋牡蠣精卵受精及早期胚胎發(fā)育過程,發(fā)現(xiàn)23℃水溫條件下,近江牡蠣在受精后25分鐘左右出現(xiàn)第1極體(

3、PB1)這有助于多倍體誘導(dǎo)時(shí)機(jī)的準(zhǔn)確把握。
　　其次,首次采用高鹽抑制太平洋牡蠣受精卵第2機(jī)體釋放產(chǎn)生三倍體,探索了高鹽誘導(dǎo)三倍體最佳誘導(dǎo)的最適條件。在水溫為25℃的條件下,分別在不同高鹽處理液(鹽度分別為40、45、50、55、60、65、70、75、80ppt),在不同處理時(shí)機(jī),當(dāng)首次、30%、50%出現(xiàn)PB1,以及首次、50%出現(xiàn)PB2時(shí),將太平洋牡蠣受精卵放入處理液中,持續(xù)處理10、15、20、25min。之后將受精卵置于

4、正常海水(鹽度為35ppt)中孵化。使用300目篩絹網(wǎng)過濾海水獲取初孵D-型幼蟲,通過流式細(xì)胞儀進(jìn)行倍性測定,以確定最佳誘導(dǎo)條件。通過誘導(dǎo)率及綜合評(píng)價(jià)指數(shù)的分析表明,高鹽誘導(dǎo)太平洋牡蠣多倍體的最佳參數(shù)為:鹽度為65,處理時(shí)機(jī)為50%PB出現(xiàn),處理持續(xù)時(shí)間20min。按照最適條件,在受精卵出現(xiàn)50% PB1時(shí),以鹽度65的高鹽海水處理受精卵20min,幼蟲的三倍體誘導(dǎo)率為65.53%。
　　通過熒光學(xué)觀察,太平洋牡蠣受精卵在受精后2

5、5min左右出現(xiàn)第一極體,30分鐘左右第一極體全部排出。由此可以確定在使用高鹽誘導(dǎo)太平洋牡蠣三倍體過程中的誘導(dǎo)時(shí)機(jī)的選擇。
　　最后,對(duì)使用高鹽誘導(dǎo)的三倍體牡蠣(8月齡)進(jìn)行了染色體組成觀察,發(fā)現(xiàn)了染色體缺失現(xiàn)象,亦即非整倍體現(xiàn)象。其中二倍體水平上的染色體缺失表現(xiàn)為2n-1和2n-2,染色體數(shù)目為18或19條;三倍體水平上的缺失發(fā)現(xiàn)了2種情況,3n-1和23n-4,染色體數(shù)為29和26。非整倍體現(xiàn)象的出現(xiàn)可能與多倍體染色體組的不穩(wěn)

6、定性有關(guān)。
　　二、低鹽誘導(dǎo)近江牡蠣三倍體
　　1.低鹽對(duì)近江牡蠣精卵影響及海水對(duì)解剖卵的促熟作用
　　用自然海水按一定比例加入蒸餾水,配制鹽度為5,10,15,20,25,30的海水。將精子滴加入不同鹽度的海水中,定時(shí)觀察精子的活動(dòng)情況。結(jié)果表明低鹽海水對(duì)精子的活動(dòng)能力有明顯影響,精子的存活時(shí)間隨著鹽度的降低而縮短,當(dāng)鹽度在10及以下時(shí),3min內(nèi)精子失去運(yùn)動(dòng)能力;隨著鹽度的升高,精子的存活時(shí)間延長,鹽度為25及30

7、時(shí),精子在2h內(nèi)保持活躍狀態(tài),3h活躍度有所降低,但仍有40%以上精子活躍。
　　鹽度對(duì)牡蠣卵子的形態(tài)和受精能力也有明顯影響。將卵子浸泡在不同鹽度海水中10min后,發(fā)現(xiàn)卵子形態(tài)大小發(fā)生變化,其卵徑大小與鹽度間呈現(xiàn)出負(fù)相關(guān)趨勢。浸泡25min后,受精實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,受精率與鹽度之間表現(xiàn)出正相關(guān)趨勢,卵子的受精率隨著鹽度降低而迅速降低,當(dāng)鹽度低于10ppt時(shí),受精率為0。
　　正常海水浸泡對(duì)牡蠣的卵子有促熟作用。浸泡時(shí)間在0.5

8、-1.5h,牡蠣卵子具有較高的受精率,但浸泡時(shí)間再延長,至2h以后之后則出現(xiàn)受精率降低的現(xiàn)象。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明近江牡蠣體解剖卵的外促熟適宜最適時(shí)間為0.5-1.5h。
　　2.低滲誘導(dǎo)近江牡蠣三倍體研究
　　低滲誘導(dǎo)近江牡蠣三倍體,分別在20%-30%、40%-50%以及60%-70%的受精卵出現(xiàn)PB1時(shí),采用不同的低鹽(鹽度為6、8、10、12、14、16)處理近江牡蠣的受精卵10、15、20min,然后將受精卵移入鹽度為30

9、的正常過濾海水中孵化。當(dāng)孵化出D-型幼蟲時(shí),收集幼蟲,DAPI熒光染色后,用流式細(xì)胞儀進(jìn)行倍性測定。通過誘導(dǎo)率及綜合評(píng)價(jià)指數(shù)的分析表明,低鹽誘導(dǎo)近江牡蠣多倍體的最佳參數(shù)為:鹽度為8,處理時(shí)機(jī)為40%-50%受精卵出現(xiàn)PB1,處理持續(xù)時(shí)間15min。按照實(shí)驗(yàn)得出的最適條件,在受精卵出現(xiàn)40%-50% PB1時(shí),以鹽度為6的低鹽海水處理受精卵15min,幼蟲的三倍體誘導(dǎo)率為89.03%,孵化率為80.23%,綜合評(píng)價(jià)指數(shù)為71.43。研究結(jié)