致病菌OMP和LPS對(duì)魚類免疫防御功能調(diào)節(jié)作用的研究.pdf

1、本文采用免疫學(xué)技術(shù)、微生物學(xué)技術(shù)、分子生物學(xué)技術(shù)、蛋白質(zhì)技術(shù)等克隆表達(dá)了溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)OmpV蛋白、從溶藻弧菌中提取了外膜蛋白Omp、從嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)中提取LPS。初步研究了FKC、OmpV、Omp對(duì)大黃魚的免疫保護(hù)作用、機(jī)體產(chǎn)生抗體的變化規(guī)律。免疫多糖對(duì)免疫有增強(qiáng)作用，可以提高黃鱔對(duì)嗜水氣單胞菌脂多糖(lipopolysaccharide，12S)的免疫反

2、應(yīng)。 根據(jù)GeneBank上已登錄的溶藻弧菌全基因序列中外膜蛋白OmpV基因序列設(shè)計(jì)1對(duì)引物。以分離到的溶藻弧菌總DNA為模板，用常規(guī)PCR方法克隆OmpV基因。PCR擴(kuò)增出一條約720bp的特異條帶。將克隆到的基因重組到pET30a載體后，在E.coli DH5 α中大量克隆后，再把重組的質(zhì)粒轉(zhuǎn)到BL21中大量表達(dá)外膜蛋白OmpV。外膜蛋白OmpV經(jīng)電泳后，發(fā)現(xiàn)其分子量為27kDa。免疫印跡試驗(yàn)表明提取的蛋白就是外膜蛋白Omp

3、V。 采用提取純化得到的外膜蛋白OmpV免疫大黃魚，注射OmpV蛋白后大黃魚沒有出現(xiàn)不良癥狀，OmpV對(duì)魚體沒有毒性。攻毒試驗(yàn)表明OmpV蛋白對(duì)大黃魚有80％的免疫保護(hù)力，是一種比較理想的疫苗。 制備溶藻弧菌的FKC、OmpV、Omp這三種疫苗。分別用這三種疫苗免疫大黃魚，從第28d開始到第56d每隔7d取血一次。從血液中分離血清，用ELISA法測(cè)定大黃魚針對(duì)FKC、OmpV、Omp這三個(gè)抗原的抗體效價(jià)。通過第28d到第

4、56d抗體效價(jià)的數(shù)據(jù)分析大黃魚針對(duì)某個(gè)抗原產(chǎn)生的抗體的變化規(guī)律，研究最佳免疫接種時(shí)間。免疫FKC之后，大黃魚的抗體水平在第28d或之前就達(dá)到了高峰。免疫OmpV后，大黃魚的抗體水平在第35d左右達(dá)到最高。免疫Omp之后，大黃魚的抗體水平在第49d的時(shí)候達(dá)到最高。研究數(shù)據(jù)表明，溶藻弧菌大規(guī)模爆發(fā)前30d是大黃魚接種疫苗最佳的時(shí)期。 將免疫多糖(酵母細(xì)胞壁)定量添加在飼料中投喂經(jīng)過免疫接種A．hydrophila脂多糖的黃鱔后，通過