仔豬常見致病菌檢測芯片的研究.pdf

1、目的：研究仔豬常見致病菌的基因芯片檢測方法。 方法：1)選取12種仔豬常見致病菌作為基因芯片檢測的靶細(xì)菌，從美國國家生物技術(shù)信息中心(NCBI)基因庫中下載它們的16S rRNA基因序列，利用Biosun2.0、DNAStar、Primer5.0等生物學(xué)軟件建立數(shù)據(jù)庫，對(duì)其進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析并在其保守區(qū)設(shè)計(jì)通用引物，在其變異區(qū)設(shè)計(jì)細(xì)菌種特異性寡核苷酸探針。2)以11種目標(biāo)細(xì)菌基因組為模板，進(jìn)行通用引物常規(guī)對(duì)稱PCR，并對(duì)擴(kuò)增的目的

2、片段做克隆測序鑒定。3)做引物不對(duì)稱PCR，以11種目標(biāo)細(xì)菌PCR產(chǎn)物為靶標(biāo)，同所設(shè)計(jì)的備選探針進(jìn)行芯片雜交，篩選特異性好、信號(hào)強(qiáng)的探針。4)優(yōu)化不對(duì)稱PCR和芯片雜交條件，包括上下游引物濃度和比例、Taq酶用量、鎂離子濃度、退火溫度、雜交液成分等要素。5)每條探針分別選取與其相關(guān)的陽性菌、陰性菌、空白對(duì)照進(jìn)行基因芯片雜交，確定每條探針的臨界值。6)以103pg、102pg、100pg、10-1pg的基因組DNA為模板做不對(duì)稱PCR擴(kuò)增

3、，然后與芯片雜交，檢驗(yàn)基因芯片體系的靈敏度。 結(jié)果：1)從49條設(shè)計(jì)的備選寡核苷酸探針中篩選出7條探針，初步建立了使用2對(duì)16s rRNA基因通用引物的支氣管敗血波氏桿菌(B.bronchiseptica，Bb)、多殺性巴氏桿(P.multocida，Pm)、C型產(chǎn)氣夾膜梭菌(C1.perfringens typeC,C1.perf)、表皮葡萄球菌(S.epidermidis,S.epi)、副豬嗜血桿菌(H.parasuis,H

4、ps)、豬鏈球菌(S.suis)，豬肺炎支原體(M.hyopneumoniae，Mhp)7種細(xì)菌基因芯片檢測方法，預(yù)期同步檢測的另外5種細(xì)菌中的4種由于16S rRNA基因序列同源性太高(胸膜炎放線桿菌豬與放線桿菌，大腸桿菌與腸道沙門氏菌)未能篩選山合適的探針，空腸彎曲菌因?yàn)楫?dāng)時(shí)缺乏樣品，尚未做雜交試驗(yàn)。2)優(yōu)化了不對(duì)稱PCR和芯片雜交條件，確定了上下游非熒光引物與熒光引物的比例為1:30、下游熒光引物終濃度為0.7μm、Taq酶用量為