病毒宏基因組學(xué)分析兒童和豬腸道病毒群落及23株病毒的初步研究.pdf

1、新發(fā)病毒性傳染病危害人和動(dòng)物的健康。挖掘和鑒定新病毒是預(yù)防、診斷和治療新發(fā)病毒性傳染病的首要任務(wù)。病毒宏基因組學(xué)是在宏基因組學(xué)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一門(mén)研究特定環(huán)境中病毒群落的新興技術(shù)。該技術(shù)已經(jīng)被廣泛地應(yīng)用到挖掘新病毒，并且取得可喜的成就。腹瀉是各個(gè)年齡段的人群中常見(jiàn)的疾病，也是影響?zhàn)B豬業(yè)經(jīng)濟(jì)效益的主要疾病之一。在世界范圍內(nèi)，每年有將近15億人腹瀉，其中兒童和年長(zhǎng)者發(fā)病率高；有200多萬(wàn)5歲以下腹瀉兒童死亡，并且發(fā)展中國(guó)家占有較大的比例。

2、目前，現(xiàn)有的檢測(cè)技術(shù)只能診斷出60％的腹瀉病例的病因，而近40%的病例查不出病因。引起未知病因的腹瀉的致病因素，可能是目前暫未被發(fā)現(xiàn)的病毒。豬作為經(jīng)濟(jì)動(dòng)物，為人類(lèi)提供了大量的肉類(lèi)，同時(shí)也是攜帶人獸共患病的宿主。腹瀉是仔豬的常發(fā)疾病，給養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。
　　我國(guó)是發(fā)展中國(guó)家。腹瀉是影響我國(guó)人民的健康主要疾病之一，尤其是兒童的健康。分析腹瀉兒童糞便中的病毒群落和發(fā)掘潛在的新病毒將為診斷不明腹瀉的病因提供新的途徑?？寺⌒虏《镜?/p>

3、基因組和流行病學(xué)調(diào)查將為預(yù)防和治療新病毒引起的腹瀉奠定基礎(chǔ)。養(yǎng)豬業(yè)在世界養(yǎng)殖業(yè)占有重要的地位。預(yù)防和控制豬病是提高養(yǎng)豬效益的最好的解決辦法，同時(shí)也是控制豬源性人獸共患病的有效途徑。研究腹瀉豬和健康豬糞便中的病毒群落及挖掘潛在的新病原，將為診斷豬病毒性疾病提供可靠的資料；克隆豬源性新病毒的基因組和流行病學(xué)調(diào)查將為預(yù)防和治療豬病毒性疾病奠定基礎(chǔ)。
　　本論文主要研究?jī)?nèi)容和結(jié)果如下：
　　（一）病毒宏基因組學(xué)分析人和豬糞便中的病毒

4、群落
　?。?）病毒宏基因組學(xué)分析腹瀉兒童糞便中的病毒群落
　　本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用病毒宏基因組學(xué)方法，構(gòu)建了12份上海腹瀉兒童糞便中病毒群落的文庫(kù)，通過(guò) sanger測(cè)序法分析了總文庫(kù)中的840個(gè)克隆。結(jié)果顯示：在上海腹瀉兒童糞便文庫(kù)中，31.4%的序列匹配到病毒，5.8%的序列匹配到噬菌體，2%的序列匹配到細(xì)菌和60.7%的序列是未知序列；病毒序列主要匹配到腸道病毒、博卡病毒、星狀病毒、Aichi virus、雙埃克病毒、Huma

5、n coavirus和Klassevirus/Salivirus；
　?。?）病毒宏基因組學(xué)分析我國(guó)豬群糞便中的病毒群落
　　本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用病毒宏基因組學(xué)方法，構(gòu)建了17份我國(guó)豬糞便中病毒群落的文庫(kù)，通過(guò)sanger測(cè)序技術(shù)分析了總文庫(kù)中的1190個(gè)克隆。結(jié)果顯示：32.9%的序列匹配到真核病毒，7.0%的序列匹配到噬菌體，2.2%的序列匹配到細(xì)菌和57.9%的序列沒(méi)有匹配到任何序列。病毒序列匹配到得豬腸道病毒、博卡病毒和星狀病

6、毒。
　　（3）病毒宏基因組學(xué)分析美國(guó)豬群糞便中的病毒群落
　　本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用病毒宏基因組學(xué)方法，通過(guò)454高通量測(cè)序分析美國(guó)18個(gè)健康豬和18個(gè)腹瀉豬糞便中病毒群落文庫(kù)。結(jié)果顯示：該文庫(kù)包含652,614個(gè)序列，最小測(cè)序長(zhǎng)度為40bp，最大測(cè)序長(zhǎng)度為699bp，測(cè)序平均長(zhǎng)度為236bp。去除引物標(biāo)簽后，文庫(kù)中的有效序列大于57萬(wàn)條，平均長(zhǎng)度為192bp。序列比對(duì)結(jié)果顯示：0.2%的序列匹配到真核基因、0.2%的序列匹配到其他序

7、列、9%的序列匹配到細(xì)菌、10%的序列匹配到噬菌體、13%的序列是未知序列及68%的序列匹配到病毒。病毒序列匹配到腸道病毒、Sapelovirus、星狀病毒、Kobuvirus、Sapovirus、Teschovirus、環(huán)狀類(lèi)病毒、博卡病毒和Rosavirus。
　?。ǘ?3株病毒的初步研究
　　（1）6株星狀病毒的初步研究
　　本實(shí)驗(yàn)克隆了上海第一株HAstV1的基因組，其大小為6808bp。分析ORF2的核苷酸

8、系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果顯示本分離株與日本分離株AB000285比較相近。通過(guò)RT-PCR檢測(cè)了上海腹瀉兒童的279份樣品，結(jié)果顯示：HAstV感染率為8.2%，主要為HAstV1。
　　本實(shí)驗(yàn)克隆了我國(guó)第一株 PAstV的基因組，其大小為6610bp。分析 ORF2編碼的氨基酸的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果顯示：本株P(guān)AstV屬于PAstV1。通過(guò)RT-nPCR檢測(cè)了來(lái)自我國(guó)5省市的340份豬糞便樣品，結(jié)果顯示有 PAstV1感染率為22.9%。<

9、br>　　本實(shí)驗(yàn)克隆了美國(guó)豬群中4株新的PAstVs（PAstV2-43、PAstV2-51、PAstV4-35和PAstV5-33）。分析ORF2編碼的氨基酸的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果顯示：PAstV2-43和PAstV2-51屬于PAstV2，與加拿大的聚為一支；PAstV4-35屬于PAstV4，與匈牙利的聚為一支；PAstV5-33單獨(dú)聚為一支，并且其與所有已知的AstV的氨基酸同源性都小于26%，其可能為PAstV的一個(gè)新種。

10、　?。?）2株HPeVs的初步研究
　　通過(guò)RT-nPCR檢測(cè)了220份上海腹瀉兒童樣品和116份腹瀉猴糞便樣品中的HPeVs。結(jié)果顯示：上海腹瀉兒童糞便中的HPeVs的陽(yáng)性率為20.5%；腹瀉猴糞便中的陽(yáng)性率為5.2%。本研究首次在猴糞便中發(fā)現(xiàn)HPeV。
　　本實(shí)驗(yàn)克隆了我國(guó)第一株HPeV1的基因組，其大小為7259bp。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析P1區(qū)核苷酸序列結(jié)果顯示該株與德國(guó)株（EF051629）和荷蘭株（FM178558）的H

11、PeV1聚為一支?？寺×藖?lái)自猴糞便中的第一株HPeV6的基因組，基因組大小為7311bp。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析 HPeV6的全基因組結(jié)果顯示該株和日本株（AB252582）和荷蘭株（EU077518）聚為一支。
　　(3) Salivirus/Klassevirus的初步研究
　　本實(shí)驗(yàn)克隆了我國(guó)第一株Salivirus/Klassevirus的基因組，其大小為7798bp。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析P1區(qū)氨基酸結(jié)果顯示該株與已報(bào)道的Sali

12、virus/Klassevirus聚為一支。該可能病毒為picornaviridae中一個(gè)新的屬。
　　通過(guò)RT-nPCR檢測(cè)了216份上海腹瀉兒童樣品和96份健康兒童樣品。結(jié)果顯示上海腹瀉兒童糞便中的Salivirus/Klassevirus的陽(yáng)性率為4.2%。通過(guò)數(shù)理統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示：Salivirus/Klassevirus和腹瀉的關(guān)聯(lián)分析差異顯著（p=0.03）。結(jié)果表明該病毒可能引起腹瀉。
　?。?）8株博卡病毒的初步

13、研究
　　本實(shí)驗(yàn)克隆了我國(guó)2株HBoV1的基因組和1株HBoV2，它們的基因組大小分別為：5288bp、5277bp和5244bp。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析HBoV1和HBoV2的基因組，結(jié)果顯示 HBoV1與我國(guó)已報(bào)道的分離株聚為一起，HBoV2與巴基斯坦（FJ170279）分離株聚為一起。通過(guò)PCR檢測(cè)了上海腹瀉兒童的320份樣品，結(jié)果顯示HBoV1和HBoV2的陽(yáng)性率分別為5.3%和5.0%。
　　通過(guò)PCR檢測(cè)來(lái)自上海3家寵物

14、醫(yī)院的158份腹瀉犬的糞便樣品，結(jié)果顯示一個(gè)樣品為 CnMV陽(yáng)性。根據(jù)美國(guó)株（FJ214110）的基因組設(shè)計(jì)引物，克隆了我國(guó)第一株CnMV的基因組，其大小為5132bp。
　　通過(guò)基因組步移，本實(shí)驗(yàn)克隆了我國(guó)2株P(guān)BoV（PBoV1-H18和PBoV2-A6），它們的基因組大小為5267 bp和5117 bp。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析了全基因組和3個(gè)基因的核苷酸和氨基酸序列結(jié)果顯示PBoV1-H18與豬boca-like virus聚為一支

15、，而PBoV2-A6與PBoV1（HM053693）和PBoV2（HM053694）聚為一起。流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示PBoV1-H18和PBoV2-A6陽(yáng)性率高達(dá)75%和70.1%。
　　本實(shí)驗(yàn)克隆了美國(guó)2株P(guān)BoV3的基因組，其大小為4710bp和4689bp。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析VP1蛋白結(jié)果顯示：PBoV3與6V和7V聚為一支。初步推測(cè)PBoV可能存在3個(gè)種（PBoV1、PBoV2和PBoV3）。
　　（5）4株P(guān)o-Circ

16、o-like Virus的初步研究
　　本實(shí)驗(yàn)克隆了4株新的Po-Circo-like Viruses，其基因組大小分別為3912bp、3923 bp、2904bp和2833bp。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析了Rep蛋白，結(jié)果顯示：4株P(guān)o-Circo-like Viruses聚為一支，其可能是環(huán)狀病毒家族中一個(gè)新的屬。這4株環(huán)狀類(lèi)病毒基因組中含有的特征結(jié)構(gòu)為：莖環(huán)結(jié)構(gòu)和Rep蛋白的保守區(qū)域（viral Rep和RNA helicase）。

17、r>　?。?）Posavirus1和Posavirus2的初步研究
　　本實(shí)驗(yàn)克隆了2株微小 RNA病毒超級(jí)家族中新的成員，暫且命名為Posavirus1和Posavirus2。其基因組大小為9816bp和10191bp。根據(jù)不同宿主的單鏈RNA病毒的堿基排列規(guī)律劃分，posavirus1和posavirus2被劃分到昆蟲(chóng)區(qū)域范圍內(nèi)。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析 RNA病毒的RdRp區(qū)域，結(jié)果顯示 posavirus1和posavirus2分別