豬星狀病毒RT-PCR檢測方法的建立及兩株江西地區(qū)豬星狀病毒全基因組測序與分析_2098.pdf

1、星狀病毒（Astrovirus）被認(rèn)為是引起嬰幼兒、老年人及抵抗力缺陷人群病毒性腹瀉的第二大病原。星狀病毒廣泛分布于世界各地，可感染人、多種哺乳動物和禽類，其基因組變異性較大，適應(yīng)宿主能力強。有研究表明星狀病毒存在不同血清型和不同種間的基因重組，并可能存在動物之間和動物與人之間的跨種傳播。星狀病毒的宿主適應(yīng)性、衣殼蛋白變異性、基因重組性使得其具有潛在的公共衛(wèi)生學(xué)危險。豬星狀病毒（Porcine Astrovirus,PAstV）可與輪狀

2、病毒、豬流行性腹瀉病毒等腸道病原混合感染引起仔豬腹瀉，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。
　　本研究根據(jù)GenBank登錄的PAstVRNA依賴型RNA多聚酶(RDRP)基因的保守區(qū)域設(shè)計引物，建立并優(yōu)化了一種快速高效的反轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測方法（Reverse Transcription–Polymerase Chain Reaction,RT-PCR)，將擴(kuò)增出的片段命名為H片段。然后，將H片段克隆至pMD18-T載體構(gòu)建重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品用

3、于敏感性檢測。敏感性檢測結(jié)果表明本研究建立的RT-PCR方法能檢測到的最低模板拷貝濃度為103copies/μl。應(yīng)用該檢測方法對從江西地區(qū)10個商業(yè)豬場采集的共219份仔豬糞便和腸組織樣品進(jìn)行了檢測，檢測結(jié)果表明PAstV在糞便樣品的陽性率為29.2％（47/161），在腸組織樣品的陽性率為51.7%（30/58）。從樣品采集時間來看，1月份的樣品陽性率最高為66.7%，3月份最低為18.7%。
　　為研究江西地區(qū)豬星狀病毒的遺

4、傳變異和分子流行病學(xué)，本研究首先對GenBank目前登錄的12條PAstV全長序列進(jìn)行了比對分析，在此基礎(chǔ)上設(shè)計了5對特異性引物，對兩株分別采集自江西吉安和江西樟樹的PAstVJXJA株和JXZS株的基因組進(jìn)行全長擴(kuò)增，另外設(shè)計了2條RACE引物對cNDA末端進(jìn)行擴(kuò)增，將擴(kuò)增的片段連接至pMD18-T載體并克隆測序。使用DNASTAR的Editseq和MegaAlign等軟件將得到的各片段序列進(jìn)行編輯和裝配，最終得到JXJA株全長為66

5、75nt，JXZS株全長為6700nt。對這兩株病毒基因進(jìn)行同源性分析，發(fā)現(xiàn)這兩株病毒全基因核苷酸和氨基酸同源性分別為82.2%和66.3%，ORF1a同源性分別為94.9%和97.6%，ORF2同源性分別為62.6%和49.9%。本研究使用MEGA6.0軟件對JXJA株、JXZS株和GenBank上登錄的其它30株哺乳動物和禽類星狀病毒參考株的全基因序列做遺傳進(jìn)化分析，對JXJA株、JXZS株和其他11株P(guān)AstV的全基因、ORF1a

6、基因、ORF2基因分別做了遺傳進(jìn)化分析。全基因組進(jìn)化樹分析結(jié)果表明豬星狀病毒JXJA株和JXZS株與豬星狀病毒4型遺傳距離最近，與鼠星狀病毒較近，存在重組的可能,與人星狀病毒較遠(yuǎn)，重組可能性較低。此外，ORF2的進(jìn)化結(jié)果表明，JXZS株與JXJA株以及其他2株4型PAstV包括野豬星狀病毒匈牙利株處于進(jìn)化樹不同分支，基于星狀病毒依據(jù)ORF2基因型分型的原則，JXZS株可能為一株新型的豬星狀病毒。
　　本研究建立了一種針對PAstV

7、的RT-PCR檢測方法，將該方法用于江西商業(yè)豬場的PAstV感染率檢測，結(jié)果表明江西地區(qū)豬群PAstV感染普遍,冬季較高。與此同時，本研究對兩株江西地區(qū)PAstV的全基因序列進(jìn)行了分析，分析結(jié)果揭示了江西地區(qū)PAstV的遺傳和變異關(guān)系，本研究的測序株與目前國內(nèi)報道的僅有的1株上海株和1株廣西株基因組差異大，提示與這兩株P(guān)AstV可能屬于不同的血清型。研究結(jié)果為PAstV的研究提供了更多的參考依據(jù)，為PAstV的診斷和防控提供了理論基礎(chǔ)和