櫻桃病毒的檢測(cè)及櫻桃病毒A基因組序列分析.pdf

1、櫻桃是我國重要的栽培果樹之一。隨著我國櫻桃栽培的發(fā)展，櫻桃病毒病逐漸成為影響櫻桃產(chǎn)量和品質(zhì)的重要因素。其中，櫻桃病毒A（CVA）在我國和其它許多國家的發(fā)生率較高，但目前對(duì) CVA種群遺傳學(xué)方面的研究甚少。本研究首先對(duì)我國4個(gè)櫻桃主產(chǎn)區(qū)12種櫻桃病毒的發(fā)生情況進(jìn)行了調(diào)查和病毒檢測(cè)，為病毒病的發(fā)生分布、病原鑒定和防治提供依據(jù)；其次，系統(tǒng)地開展了CVA全基因組序列擴(kuò)增和種群遺傳學(xué)分析等研究，分析我國CVA分離物的遺傳進(jìn)化機(jī)制，為預(yù)防CVA的發(fā)

2、生和流行提供理論基礎(chǔ)。
　　1.對(duì)我國北京、遼寧大連、山東泰安和煙臺(tái)四個(gè)櫻桃主產(chǎn)區(qū)的病毒病發(fā)生情況進(jìn)行調(diào)查和病毒檢測(cè)。結(jié)果表明，幾個(gè)果園均有病毒病發(fā)生，主要為害癥狀表現(xiàn)為卷葉、花葉、黃綠斑駁、植株矮縮等。通過對(duì)采集的60份樣品的12種病毒的RT-PCR檢測(cè)和序列分析表明：CVA檢出率最高，達(dá)70％；李屬壞死環(huán)斑病毒(PNRSV)檢出率為53.3%；櫻桃綠環(huán)斑駁病毒(CGRMV)檢出率為45%；蘋果褪綠葉斑病毒(ACLSV)檢出率為

3、21.7%；櫻桃小果病毒-1(LChV-1)檢出率為35%；李矮縮病毒(PDV)檢出率為5%；李樹皮壞死與莖痘伴隨病毒(PBNSPaV)檢出率為3.3%。同時(shí)，通過對(duì)LChV-1的另一個(gè)基因片斷的擴(kuò)增，首次證實(shí)了LChV-1在我國甜櫻桃上的侵染。
　　2.設(shè)計(jì)擴(kuò)增長片段的特異性引物，對(duì) CVA的兩個(gè)中國分離物 ChTA11和 ChTA12進(jìn)行RT-PCR和RACE擴(kuò)增。結(jié)果顯示，1）不包括Poly(A)結(jié)構(gòu)，兩個(gè)中國分離物的基因組

4、大小均為7382 nt，與 GenBank中登錄的兩個(gè)全基因組序列結(jié)構(gòu)相同，編碼兩個(gè)開放閱讀框（ORF）；2）序列比對(duì)結(jié)果表明，ChTA11和ChTA12與德國分離物的核苷酸序列相似性均為98.2%；與印度分離物的核苷酸序列相似性分別為81.2%和81.0%。對(duì)ORF的幾個(gè)基因功能區(qū)的核苷酸和氨基酸序列分析表明，未知功能區(qū)（DUF1717）的變異較大；3）基于CVA全基因組序列和部分CP編碼區(qū)序列的系統(tǒng)發(fā)育分析表明CVA中國分離物與德國

5、分離物的關(guān)系較近。這是我國櫻桃上CVA全長基因組序列的首次報(bào)道。
　　3.用種群遺傳學(xué)的分析方法對(duì)31個(gè)CVA中國分離物的CP、RdRp和MP基因全序列的遺傳學(xué)相關(guān)參數(shù)進(jìn)行了分析。結(jié)果表明：1）重組分析中發(fā)現(xiàn)CP、RdRp和MP三個(gè)編碼區(qū)內(nèi)均存在重組事件，發(fā)現(xiàn)了4個(gè)CVA的重組體；2）基于CP與RdRp基因的系統(tǒng)發(fā)育樹分為3個(gè)組群，有較為一致的遺傳進(jìn)化歷史，而基于MP基因的系統(tǒng)發(fā)育樹分為6個(gè)組群，二者的差異可能來源于基因組結(jié)構(gòu)中不

6、同ORF的進(jìn)化程度不同（ORF1編碼CP和RdRp；ORF2編碼MP）；大多數(shù) CVA中國分離物與德國分離物簇在大組 I；3）選擇壓分析表明 CVA在 CP、RdRp和MP三個(gè)編碼區(qū)內(nèi)均處于強(qiáng)的負(fù)選擇壓力作用下；4）核苷酸/單體型多樣性分析和中性檢測(cè)分析表明，CVA中國分離物序列遺傳多樣性程度較高，CVA系統(tǒng)發(fā)育樹組I種群處于擴(kuò)張趨勢(shì)中；5）遺傳分化和基因交流分析表明，CVA不同組間基因交流較少，存在一定程度的遺傳分化，但是不同地理種群