肝型脂肪酸結合蛋白與非酒精性脂肪肝的關系及藥物研究.pdf

1、目的：非酒精性脂肪肝(nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)是指與過量飲酒無關的，以肝細胞彌漫性脂肪變性和脂質(zhì)貯積為主的臨床病理綜合征。NAFLD的發(fā)病率逐年上升，發(fā)病年齡逐漸年輕化，已成為全球性的公共衛(wèi)生問題。然而NAFLD的發(fā)病機制尚未明確，臨床上仍無有效的治療手段。目前研究發(fā)現(xiàn)，肝型脂肪酸結合蛋白(fattyacid-binding protein，L-FABP)與高甘油三酯血癥、高膽固醇血

2、癥、肥胖、2-型糖尿病等的形成密切相關。為此，本實驗通過高脂飲食建立非酒精性脂肪肝大鼠模型，來觀察L-FABP在NAFLD形成過程中的表達，初步探討L-FABP在NAFLD發(fā)病機制中的作用；同時觀察降脂益肝沖劑對肝組織中L-FABPmRNA表達的影響，探討其可能的分子治療機制，為臨床應用提供更加可靠的實驗依據(jù)。
　　 方法：
　　 1.造模與取材雄性清潔級Wistar大鼠80只，重量約為160～220g，適應性喂養(yǎng)1周后

3、，開始正式實驗。隨機分為8組，每組10只，其中正常組(N1，N2，N3組)以普通飼料喂養(yǎng)，模型組(M1，M2，M3組)和治療組(D1,D2組)以高脂飼料喂養(yǎng)。每天8:00～9:00am，4:00～5:00pm為喂食和給藥的時間。實驗動物自由進食和飲水，治療D1組在給予高脂飲食喂養(yǎng)的同時即給予降脂益肝沖劑16g·Kg-1·d-1(按成年人60kg體質(zhì)量的劑量(40g/d)計算出大鼠藥物劑量)，分2次灌胃(ig)，共8周；治療D2組于8周末

4、時給予降脂益肝沖劑，ig(劑量、用法同D1組)，共4周。同時模型組和正常組分別給予等量的生活飲用水，ig。在實驗第4周末處死正常組(N1組)、模型組(M1組)；在實驗第8周末處死正常組(N2組)、模型組(M2組)和治療組(D1組)大鼠，于12周末處死其余組大鼠。所有大鼠處死前均隔夜禁食并用水合氯醛麻醉，腹主動脈采血，各組大鼠于肝左葉相同部位留取0.1g組織置于1.5mL EP管，-70℃冰箱凍存，用于RT-PCR的檢測；另取肝右葉相同部

5、位(1 cm×1cm×0.5cm)組織，在4％多聚甲醛中固定，常規(guī)制片、HE染色。
　　 2.檢測指標：測量各實驗鼠的體重、肝脾濕重及體長，并計算肝脾比值、肝指數(shù)及Lee's指數(shù)等體質(zhì)指標；將采集的全血用低溫離心機迅速分離血漿，丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)、血脂(TC，TG)以及肝組織脂質(zhì)含量在全自動生化分析儀(Olympus Au1000)上測定；采用銅染色法測定血清和肝組織中的FFA水平；采用葡萄糖氧化酶

6、法測定空腹血糖(FBG)；空腹胰島素(FINS)測定步驟按照放免試劑盒操作步驟進行，并計算胰島素敏感指數(shù)(ISI=ln[1/(FINS×FBG)])；在光鏡下評估脂肪變性的程度；半定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(reverse transcriptase-polymerase chain reaction，RT-PCR)測定L-FABP mRNA的動態(tài)表達。
　　 結果：
　　 1.正常組(N1，N2，N3組)肝小葉結構完整，肝

7、細胞呈多邊形，圍繞中央靜脈呈放射狀，肝竇清晰可見，肝索排列整齊；各項檢測指標均在正常范圍內(nèi)，并可觀察到L-FABP mRNA的表達。
　　 2.造模4周末(M1組)，模型組肝組織呈現(xiàn)輕度脂肪變性；血清轉(zhuǎn)氨酶較正常組有所升高；總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、FFA升高，開始出現(xiàn)脂質(zhì)代謝紊亂；FBG，F(xiàn)INS開始升高，ISI有所下降，出現(xiàn)輕度胰島素抵抗；肝組織L-FABP mRNA的表達較其正常組升高。
　　 3.造模8

8、周末(M2組)，模型組肝組織呈中度脂肪變性及部分氣球樣變，形成單純性脂肪肝，肝脂肪變以大泡性為主；血清轉(zhuǎn)氨酶(ALT,AST)、血脂(TC，TG，F(xiàn)FA)較正常組顯著升高；肝組織L-FABP mRNA的表達較其同期正常組顯著升高(P＜0.01)。
　　 4.造模12周末(M3組)，模型組肝組織脂肪變加劇并出現(xiàn)肝細胞完全氣球樣變、小葉內(nèi)混合有炎癥細胞浸潤以及散在的點狀壞死；與正常組相比，血清轉(zhuǎn)氨酶、總膽固醇、甘油三酯較正常組顯著升

9、高；與正常組相比，肝組織L-FABP mRNA的表達顯著升高(P＜0.01)。
　　 5.用藥組(D1組)，在細胞形態(tài)、血脂、轉(zhuǎn)氨酶及肝組織肝型脂肪酸結合蛋白的表達量，與正常組(N1組)比較均無統(tǒng)計學差異，但與4周模型組M1相比，各項指標均有所改善，具有統(tǒng)計學差異(P＜0.01)。
　　 6.用藥組(D2組)，肝組織仍可見索條狀排列的肝細胞，脂變程度較同期模型組明顯減輕，僅有輕微的炎性細胞浸潤，未見明顯壞死灶；與M2組相

10、比，ALT,AST,TC，TG明顯降低，F(xiàn)BG,FINS亦顯著降低，L-FABPmRNA的表達量明顯下調(diào)(P＜0.01)。
　　 結論：
　　 1.高脂高膽固醇飲食可成功的復制NAFLD大鼠模型；胰島素抵抗及脂質(zhì)代謝紊亂與NAFLD的發(fā)生關系密切。
　　 2.正常大鼠肝臟可表達L-FABP mRNA，NAFLD模型的大鼠L-FABP mRNA增高，且隨造模時間延長表達量明顯升高，其增高的程度與NAFLD的程度呈正

11、相關。
　　 3.在NAFLD早期，給予降脂益肝沖劑，可有效的預防NAFLD的發(fā)病。
　　 4.降脂益肝沖劑可使ALT,AST,TC，TG，F(xiàn)FA顯著降低，說明該藥不僅能夠逆轉(zhuǎn)肝臟的脂質(zhì)沉積，而且具有很好的降酶保肝的作用；可使FBG,FINS顯著降低，證實該藥物可通過有效的改善胰島素抵抗來達到對NAFLD良好的治療效果；而L-FABP mRNA的表達明顯降低，表明降脂益肝沖劑可以通過調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝，減輕肝細胞的脂肪變性，從