非酒精性脂肪肝大鼠肝組織能量代謝及其藥物干預(yù).pdf

1、一、研究背景：非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholicfattyliverdisease，NAFLD)是遺傳-環(huán)境-代謝應(yīng)激相關(guān)性的肝臟疾病，在病理上包括單純性脂肪肝(non-alcoholicfattyliver，NAFL)及由其演變而來(lái)的脂肪性肝炎(non-alcoholicsteatohepatitis，NASH)和脂肪性肝硬化(fattylivercirrhosis，F(xiàn)LC)等類(lèi)型。 1998年Day等提出了“二次

2、打擊”的NAFLD發(fā)病機(jī)制：“初次打擊”主要是胰島素抵抗(insulinresistance，IR)，它通過(guò)促使外周脂肪分解增加和高胰島素血癥引起肝細(xì)胞脂肪儲(chǔ)積，并誘使肝細(xì)胞對(duì)損害因子的敏感性增高；“二次打擊”主要是氧應(yīng)激、脂質(zhì)過(guò)氧化、線粒體解偶聯(lián)蛋白(TNF-α的調(diào)節(jié)基因)表達(dá)增加、細(xì)胞因子及Fas配體被誘導(dǎo)活化，從而引起炎癥和纖維化。 “二次打擊”學(xué)說(shuō)強(qiáng)調(diào)了NAFLD發(fā)病機(jī)制中線粒體、氧應(yīng)激、脂質(zhì)過(guò)氧化及細(xì)胞防御機(jī)制改變的作

3、用及其相互關(guān)聯(lián)的關(guān)系。這無(wú)疑會(huì)促進(jìn)相關(guān)分子生物學(xué)的研究，探尋與NAFLD遺傳敏感性有關(guān)的基因，開(kāi)拓臨床防治對(duì)策的新思路。但目前臨床上還缺乏可靠的氧應(yīng)激和脂質(zhì)過(guò)氧化等生化標(biāo)志物，故對(duì)疑有炎癥和纖維化的脂肪肝患者常進(jìn)行組織學(xué)檢查，以期提供合理有效的治療方法。該學(xué)說(shuō)還處于萌芽階段，盡管提出了基本概念，但總體理論體系仍不夠完整，有待進(jìn)一步的研究。 NAFLD是典型的代謝性疾病，脂質(zhì)代謝異常貫穿了其發(fā)病的整個(gè)過(guò)程。正常情況下機(jī)體內(nèi)的游離脂

4、肪酸(freefattyacids，F(xiàn)FA)在肝臟與外周脂肪組織間進(jìn)行循環(huán)，肝細(xì)胞內(nèi)沒(méi)有多余的脂質(zhì)沉積[3]。當(dāng)長(zhǎng)期大量高脂飲食(FFA攝入過(guò)多)及發(fā)生IR(脂肪組織分解，F(xiàn)FA釋放增加)等時(shí)，F(xiàn)FA則過(guò)多地進(jìn)入肝細(xì)胞。由于FFA是具有高度細(xì)胞毒性的兩性分子，導(dǎo)致肝細(xì)胞線粒體功能損傷，脂肪酸β氧化障礙，肝細(xì)胞能量穩(wěn)態(tài)發(fā)生改變。測(cè)定肝組織細(xì)胞中主要能量代謝物質(zhì)含量，可以指示肝細(xì)胞線粒體儲(chǔ)存三磷酸腺苷(adenosinetriphospha

5、te，ATP)以及把二磷酸腺苷(adenosinediphosphate，ADP)、一磷酸腺苷(adenosinemonophosphate，AMP)轉(zhuǎn)化成ATP的能力。 本研究擬建立營(yíng)養(yǎng)性脂肪肝大鼠模型，同時(shí)給予“安琺特”藥物干預(yù)，應(yīng)用高效液相色譜法(high-performanceliquidchromatography，HPLC)，測(cè)定肝組織中ATP、ADP、AMP的含量，計(jì)算其能荷(energycharge，EC)變化，

6、與生化指標(biāo)和病理形態(tài)學(xué)比較。 二、研究目的：為了觀察NAFLD大鼠肝臟的能量代謝及其在藥物干預(yù)情況下的變化，本研究擬建立營(yíng)養(yǎng)性脂肪肝大鼠模型，同時(shí)給予安琺特治療，應(yīng)用HPLC法測(cè)定肝組織中ATP、ADP、AMP含量并計(jì)算其能荷(EC)變化，進(jìn)一步闡明NAFLD的發(fā)病機(jī)制，并為抗脂肪肝藥物的開(kāi)發(fā)和臨床療效觀察提供方法。 三、研究方法：選擇S-D大鼠(♂，體重150-160克)60只，編號(hào)后隨機(jī)分為：正常對(duì)照組，高脂模型組，

7、安琺特大、中、小劑量治療組等5組。選用的高脂飼料配方為基礎(chǔ)飼料80.5％、膽固醇2％、蛋黃粉10％、豬油7％、膽鹽0.5％。高脂模型復(fù)制成功后，從第8周末開(kāi)始給予安琺特(大、中、小劑量為40、24、15mg/kg/d)灌胃，每天1次。每周記錄動(dòng)物體重1次，根據(jù)體重變化調(diào)節(jié)灌胃劑量，連續(xù)進(jìn)行直至16周末給藥周期結(jié)束。飼養(yǎng)條件：飼養(yǎng)室內(nèi)溫度為25℃±1℃，相對(duì)濕度為55％±5％，充分給水，自由攝食。 在給藥結(jié)束后，股靜脈采血，測(cè)定大

8、鼠血液甘油三酯(TG)、膽固醇(TC)、天門(mén)冬酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)等指標(biāo)。觀察肝臟器大體情況，完整切除肝臟并稱重后，一部分于液氮罐中保存供能量物質(zhì)檢測(cè)，另一部分浸泡于福爾馬林固定，石蠟包埋，切片，HE染色，光鏡下觀察。 肝組織能量代謝物質(zhì)采用HPLC法測(cè)定。色譜條件為：反相色譜柱(Lichrospher5-C18，250cm×4.6mm×5μm)，0.1mol/L磷酸二氫銨(pH6.25)為流動(dòng)相，

9、流速為0.8mL/min，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為254nm，進(jìn)樣量為10μl。ATP、ADP、AMP測(cè)定結(jié)果以ng/mg組織表示。 四、研究結(jié)果：正常對(duì)照組大鼠肝臟表面光滑，紅潤(rùn)，無(wú)結(jié)節(jié)，質(zhì)軟。高脂模型組肝臟體積增大，邊緣鈍，色淡黃，質(zhì)軟，切面有油膩感。H.E染色光鏡下觀察正常對(duì)照組(8周和16周)大鼠肝臟細(xì)胞排列正常，肝小葉規(guī)則，胞質(zhì)內(nèi)未見(jiàn)脂肪滴，匯管區(qū)、小葉內(nèi)未見(jiàn)炎細(xì)胞浸潤(rùn)。高脂模型組8周末HE染色鏡下肝細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)為大、小空泡所占據(jù)

10、，將細(xì)胞核擠壓至一側(cè)，小葉中央?yún)^(qū)受累明顯，同時(shí)肝小葉、匯管區(qū)出現(xiàn)明顯炎細(xì)胞浸潤(rùn)。16周末高脂模型組大鼠肝細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)大空泡彼此融合成大小不一的脂囊，小葉內(nèi)大量的炎細(xì)胞浸潤(rùn)。上述病理學(xué)改變提示第8周末，已經(jīng)成功復(fù)制了大鼠非酒精性脂肪肝模型；并且隨著造模時(shí)間延長(zhǎng)，病變程度加重，提示本模型可以用于發(fā)病機(jī)制和藥物療效研究。安琺特各治療組的肝臟肉眼觀介于正常對(duì)照組和高脂模型組之間，肝臟體積均增大，邊緣鈍，色淡黃，質(zhì)軟。光鏡下各治療組肝臟病變程度均輕

11、于模型組，大、中劑量之間差異較小，胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)很多小脂滴，但尚未擠壓細(xì)胞核，可見(jiàn)炎細(xì)胞浸潤(rùn)；小劑量組肝細(xì)胞核周小空泡已融合成大小不一的脂囊，可見(jiàn)炎細(xì)胞浸潤(rùn)。 入選分組時(shí)各組大鼠體重?zé)o明顯差別。16周時(shí)，高脂模型組與正常對(duì)照組比較，體重變化無(wú)差別，肝濕重、肝指數(shù)均增加，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；大劑量治療組和高脂模型組相比體重下降，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；安琺特各治療組分別和正常對(duì)照組相比大鼠肝濕重和肝指數(shù)(肝濕重

12、/體重×100％)均增加，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；安琺特各治療組分別與高脂模型組比較，各治療組肝濕重均減輕，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；大、中劑量治療組肝指數(shù)減少，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。 肝功能指標(biāo)高脂模型組與正常對(duì)照組比較，ALT、AST均升高，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)；安琺特各治療組與正常對(duì)照組比較，ALT、AST均明顯升高，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；安琺特各治療組與高脂模型組比較

13、，ALT、AST差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。 血脂指標(biāo)高脂模型組與正常對(duì)照組比較，TC升高，TG降低，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)；安琺特各治療組與正常對(duì)照組比較，TC均升高，TG均降低，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；各治療組與高脂模型組比較，TG、TC差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；各治療組間兩兩比較，差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。 高脂模型組大鼠與正常對(duì)照組相比，肝組織細(xì)胞能量代謝出現(xiàn)ATP、AD

14、P、AMP均普遍降低，肝細(xì)胞EC貯備也下降，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。 安琺特各治療組大鼠肝臟能量代謝指標(biāo)(ATP、ADP、AMP和EC)與正常對(duì)照組比較均下降(P＜0.05)；而與高脂模型組比較能量代謝指標(biāo)含量均增加，除AMP外差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。安琺特大、中、小劑量組之間的能量代謝指標(biāo)比較，均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。 五、研究結(jié)論：研究結(jié)果顯示NAFLD大鼠肝組織能量代謝變化表現(xiàn)為ATP、A