肝硬化肝癌立體定向照射細(xì)胞因子及病理學(xué)觀察的實驗研究.pdf

1、原發(fā)性肝癌(hepatocarcinoma，HCC，簡稱肝癌)是我國常見的惡性腫瘤之一，居我國癌癥發(fā)病率的第二位，每年有13萬人死于肝癌，尤以東南沿海地區(qū)高發(fā)。目前早期肝癌治療仍首選外科手術(shù)，但手術(shù)率僅為5％～10％左右。隨著放射物理的發(fā)展，適形放療技術(shù)的實施，放射治療已逐漸成為非手術(shù)治療肝癌的主要方法之一。由于90％以上的肝癌患者合并慢性肝炎或者肝硬化，而肝病狀態(tài)下的放射耐受量明顯低于正常肝組織，故本研究擬從放射病理學(xué)角度探討肝病狀態(tài)

2、下放射性肝損傷，以進一步指導(dǎo)臨床治療。 研究目的： 1.制備肝硬化肝癌模型，為探討肝病狀態(tài)下放射性肝損傷提供理論依據(jù)； 2.觀察肝病狀態(tài)下肝癌照射后放射性肝損傷的血清學(xué)、細(xì)胞因子及病理形態(tài)學(xué)變化； 3.確定臨床三維適形放療肝硬化肝癌的照射劑量，指導(dǎo)肝癌三維適形放療，減少放射性肝損傷，提高臨床治療效果。 材料和方法： 1.兔肝硬化肝癌模型的制備： (1)兔肝硬化模型的制備：

3、25只雄性新西蘭大白兔，采用四氯化碳(CCl4，1.598g/ml)胃內(nèi)給藥方法，1次/周，起始劑量為50mg/Kg，加入2ml玉米油中混合成5％的油溶液，并根據(jù)實驗組耐受情況逐漸加量，最大劑量可加量至CCl4160mg/Kg，加入3ml玉米油中合成10％油溶液。給藥共6個月，同時抽血了解實驗組肝功5項(谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、白蛋白、總膽紅素、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶)血清學(xué)變化，6個月后抽血行肝纖維四項檢查(透明質(zhì)酸、層粘連蛋白、Ⅲ型前膠原

4、、Ⅳ型膠原)，選取樣本作病理常規(guī)檢查，了解是否制成兔肝硬化模型。 (2)兔肝硬化后肝癌模型的制備： 16只成功制成肝硬化的實驗兔(實驗組)，按外科手術(shù)方法將VX2腫瘤細(xì)胞原位接種在兔肝右葉上。10只正常雄性新西蘭大白兔(對照組)，按上述手術(shù)方法同樣接種VX2腫瘤細(xì)胞。接種肝癌前后抽血觀察其血清學(xué)肝功能五項變化。 2.動物分組： 將己成功建立的肝硬化肝癌兔16只(實驗組)隨機分為兩組，每組8只，分別給予立體

5、定向照射(SRT)單次劑量20Gy、30Gy；8/10只單純接種肝癌兔(對照組)亦隨機分為兩組，每組4只，按上述方法分別給予立體定向照射單次劑量20Gy、30Gy。照射前后同樣抽血觀察其血清學(xué)肝功五項變化。 3.病理形態(tài)學(xué)觀察及細(xì)胞因子表達分析： 照射后3周分別處死實驗組與對照組，應(yīng)用常規(guī)HE染色比較照射前后實驗組與對照組肝臟病理形態(tài)學(xué)變化；用網(wǎng)狀纖維染色、Masson三色比較和確定照射前后實驗組與對照組肝臟纖維化程度；

6、EV二部法觀察照射后實驗組與對照組肝臟PCNA、GST-π等細(xì)胞因子變化。所有病理學(xué)觀察均由兩位病理學(xué)專家雙盲法作出判斷。 4.統(tǒng)計學(xué)處理： 應(yīng)用SPSS11.5軟件包分析實驗組和對照組在立體定向照射后細(xì)胞因子表達；分析實驗組和對照組在制備模型過程中及照射前后的血清學(xué)變化。 結(jié)果： 1.兔肝硬化肝癌模型的觀察： 25只新西蘭大白兔CCl4誘導(dǎo)并接種VX2瘤株后肝硬化肝癌模型成功16只(64％)，死

7、亡9只(36％)。CT檢查平掃可見肝內(nèi)大小不等的低密度軟組織影，最大直徑為5.0cm，最小直徑為1.0cm，最終解剖右肝可見大小不等的白色結(jié)節(jié)，經(jīng)病理形態(tài)學(xué)證實為腫瘤組織。實驗兔誘癌過程中早期死亡原因主要是CCl4引起的肝、肺腐蝕性壞死，胃穿孔及全身多臟器功能衰竭；后期死亡原因主要是感染、腫瘤引起的全身多臟器功能衰竭。10只對照組接種VX2瘤株致肝癌模型成功8只(80％)，死亡2只(20％)。死亡原因為感染引起的多發(fā)性肺膿腫導(dǎo)致肺功能衰

8、竭和腫瘤全身轉(zhuǎn)移導(dǎo)致死亡。 2.實驗組與對照組照射前后病理形態(tài)學(xué)觀察： (1)照射前肝組織病理學(xué)觀察： 對照組肝臟結(jié)構(gòu)大致正常，肝細(xì)胞呈索狀排列，少數(shù)肝細(xì)胞可見脂肪變性，血竇輕度擴張，匯管區(qū)內(nèi)結(jié)締組織增生不明顯，未見肝細(xì)胞分割現(xiàn)象，匯管區(qū)內(nèi)可見少量淋巴細(xì)胞浸潤，肝右葉肝組織內(nèi)可見接種的VX2細(xì)胞團，少數(shù)癌細(xì)胞可見凋亡及壞死，VX2細(xì)胞團周圍可見少量結(jié)締組織增生； 實驗組肝組織中正常結(jié)構(gòu)被破壞，匯管區(qū)有較多

9、纖維組織增生，分割肝小葉成假小葉結(jié)構(gòu)，在肝硬化組織內(nèi)可見呈片巢狀分布的瘤細(xì)胞團，瘤細(xì)胞異型明顯，分裂象及病理性核分裂象多見，核圓，卵圓形，可見瘤巨細(xì)胞，瘤細(xì)胞團周圍可見纖維組織增生，其內(nèi)有散在的淋巴細(xì)胞浸潤。 (2)照射后組織病理學(xué)觀察： 腫瘤區(qū)瘤細(xì)胞大片壞死，部分瘤細(xì)胞核固縮及核碎裂，周邊可見殘留少許瘤組織，間質(zhì)血管擴張、充血，局部有出血，間質(zhì)纖維組織增生腫脹，部分纖維組織斷裂，壞死灶周圍有較多炎癥細(xì)胞浸潤，以中性粒細(xì)

10、胞為主。實驗組以近腫瘤組織周圍的肝細(xì)胞壞死較明顯，周圍纖維組織斷裂；對照組瘤組織周邊肝細(xì)胞以變性為主，可見少量肝細(xì)胞小灶性壞死，纖維組織無明顯變化。實驗組及對照組均未見到肝靜脈閉塞或血栓形成。 3.照射前后網(wǎng)狀纖維及Masson三色觀察： 實驗組照射后與照射前相比，周圍纖維組織斷裂；對照組照射前后纖維組織無明顯改變。 4.照射后細(xì)胞因子表達： PCNA陽性細(xì)胞主要在細(xì)胞核內(nèi)表達，GST-π陽性部位主要定位

11、在細(xì)胞漿，陽性細(xì)胞呈棕黃色。根據(jù)陽性細(xì)胞數(shù)進行統(tǒng)計學(xué)分析，結(jié)果如下： (1)照射后PCNA、GST-π在癌周組織的表達： ①照射20Gy實驗組比對照組的癌周組織表達高，兩組間有顯著性差異(P=0.010)； ②照射30Gy實驗組與對照組的癌周組織表達相似，兩組間無統(tǒng)計學(xué)差異(P=1.000)； ③實驗組不同劑量照射后，高劑量組(30Gy)細(xì)胞因子的表達比低劑量組(20Gy)細(xì)胞因子的表達低，兩組間有顯著性

12、差異(P=0.010)。 (2)照射后PCNA、GST-π在肝癌組織的表達： 實驗組不同劑量照射，高劑量組(30Gy)細(xì)胞因子的表達比低劑量組(20Gy)細(xì)胞因子的表達低，兩組間有顯著性差異(P=0.010)。 5.血清學(xué)變化： (1)實驗組制備肝硬化過程中抽血共6次，每月1次，其中ALT、AST變化在第5、6次均有顯著性差異，γ-GT、ALB、TBIL在6次抽血里均無統(tǒng)計學(xué)意義。對照組肝功能五項指標(biāo)在6

13、次抽血中均無統(tǒng)計學(xué)意義。 (2)肝硬化模型制成后，與對照組相比，實驗組肝纖四項指標(biāo)均有顯著性差異(P＜0.01)。 (3)實驗組接種腫瘤前后，ALT、AST、γ-GT變化均有不同程度升高，三者均有顯著性差異，ALB、TBIL變化無統(tǒng)計學(xué)意義。對照組的肝功能五項指標(biāo)接種腫瘤前后均無統(tǒng)計學(xué)意義。 (4)實驗組照射前后(20Gy或30Gy)ALT、AST、γ-GT變化均有不同程度的下降，三者有顯著性差異。 (5

14、)實驗組20Gy照射和30Gy照射后，ALT、γ-GT無統(tǒng)計學(xué)差異，AST有統(tǒng)計學(xué)差異。 結(jié)論： 1.CCl4誘導(dǎo)的兔肝硬化接種VX2瘤株制成的肝硬化肝癌模型是一種理想的肝硬化肝癌研究的動物模型； 2.照射后腫瘤細(xì)胞大片壞死，肝硬化背景肝細(xì)胞壞死較明顯，周圍纖維組織斷裂；正常肝照射后肝細(xì)胞以變性為主，纖維組織無明顯變化；兩組均未見到肝靜脈閉塞或血栓形成； 3.PCNA、GST-π可作為評價肝硬化肝癌照射效