一種新的Bifidobacterium infantis細(xì)菌素的分離，鑒定和性質(zhì)分析.pdf

1、雙歧桿菌在母乳喂養(yǎng)兒腸道內(nèi)大量存在，對嬰幼兒有很多好處，如營養(yǎng)、免疫及抗感染作用等。多年的臨床研究表明，人在攝入一定量的雙歧桿菌除了能提供基本的營養(yǎng)作用之外，還有抗過敏、抗腫瘤、調(diào)整腸道功能等多種促進(jìn)人體健康的作用，作為一種益生菌，雙歧桿菌在食品和醫(yī)藥領(lǐng)域有著越來越多的應(yīng)用。但在雙歧桿菌對致病菌的抑制作用研究方面，人們一直認(rèn)為雙歧桿菌之所以能夠抗菌是因為它們能產(chǎn)生有機酸，如乳酸和乙酸等，而最新的研究表明某些雙歧桿菌中基因編碼的抗菌肽(細(xì)

2、菌素或類細(xì)菌素類物質(zhì))也是它們有抑菌活性的重要原因之一。
　　 本論文選擇Bifidobacterium ado/escentis(B.adolescentis，青春雙歧桿菌)，Bifidobacterium bifidum(B. bifidum，兩歧雙歧桿菌)，Bifidobacterium infantis(B。infantis，嬰兒雙歧桿菌)和Bifidobacterium longum(B.longum，長雙歧桿菌)四株

3、菌為出發(fā)菌株，采用Bacillus cereus(B. cereus，蠟狀芽孢桿菌)和Eschenichia coli(E。coli，大腸桿菌)為指示菌進(jìn)行發(fā)酵上清液的抗菌活性檢測。實驗結(jié)果表面四株雙歧桿菌均有抑菌效果，對在對數(shù)生長期的E.coli的抑制率均在75%以上，其中B.infantis對E.coli AS1.543的抑制率達(dá)95%；而對在對數(shù)生長期的B.cereus的抑制率比對E.coli的低些，但也均在60%以上，其中B.l

4、ongum對B.cereus的抑菌效果達(dá)到75%。在此基礎(chǔ)上，選擇B.Infantis和B.longum的發(fā)酵上清液進(jìn)行蛋白酶酶解實驗，結(jié)果確認(rèn)了這些抑菌物質(zhì)是一些蛋白質(zhì)，而不是有機酸，對這些抑菌蛋白物質(zhì)的抑菌熱穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性的研究進(jìn)一步確認(rèn)了這些物質(zhì)是一些細(xì)菌素或者是類細(xì)菌素物質(zhì)。初步的實驗結(jié)果表明來自B.Infantis的抑菌物質(zhì)的熱穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性都較B.longum的強，因此本論文選擇Bifidobacterium inf

5、antis BCRC14602進(jìn)行后續(xù)的實驗，對其產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)進(jìn)行分離純化、鑒定及性質(zhì)分析。
　　 由于來自Bifidobacterium infantis BCRC14602的類細(xì)菌素物質(zhì)的性質(zhì)和已經(jīng)報道的細(xì)菌素性質(zhì)較接近，它們也是分泌到發(fā)酵上清液。因此硫酸銨沉淀、與生產(chǎn)菌的吸附解吸、與硅酸吸附解吸等提取方法也適用于本菌株所產(chǎn)生的類細(xì)菌素物質(zhì)的首步分離。在硫酸銨沉淀實驗中，采用80%的硫酸銨和發(fā)酵上清液反應(yīng)沉淀得到蛋白質(zhì)，其

6、含有的總抑菌活性達(dá)80%，比活力上升了4.56倍，回收產(chǎn)物經(jīng)透析后比活力上升了76倍，但總活力僅剩8%。而在類細(xì)菌素物質(zhì)與生產(chǎn)菌吸附和解吸試驗中，類細(xì)菌素物質(zhì)的吸附受發(fā)酵的pH影響顯著，在pH6.0到7.0之間，死亡的細(xì)菌能100%吸附細(xì)菌素類物質(zhì)，在pH1.5到2.0之間，類細(xì)菌素物質(zhì)開始從生產(chǎn)菌上解吸。這種方法能將類細(xì)菌素物質(zhì)純化120倍，比活力達(dá)31605 AU/mg，得率為64%。在類細(xì)菌素物質(zhì)與硅酸的吸附試驗中，再次確認(rèn)了類細(xì)

7、菌素物質(zhì)在硅酸(5%)上的吸附受發(fā)酵液pH影響顯著。在pH5.0到7.0之間，吸附率達(dá)100%，當(dāng)pH值低于5.0或高于7.0時，吸附率分別為67%和45%。本實驗表明硅酸吸附解吸適合Bifidobacteriuminfantis BCRC14602中類細(xì)菌素物質(zhì)的純化，純化倍數(shù)和回收率都較其它兩種方法高。因此本文后續(xù)實驗中類細(xì)菌素物質(zhì)的首步分離將采用硅酸吸附解吸法。
　　 由于Bifidobacterium infantis

8、BCRC14602所產(chǎn)的類細(xì)菌素物質(zhì)對許多格蘭氏陽性菌和陰性菌都有抑制效果，我們將其定義為bifidin I，其抑菌模式與Lactobacillusplantarum(L.plantarum，植物乳桿菌)BCRC11697類似。對Bifidobacterium infantisBCRC14602使用MRS培養(yǎng)，37℃培養(yǎng)6小時后到對數(shù)中期，酶活為400 AU/ml，16小時后進(jìn)入穩(wěn)定期，最大酶活為1600 AU/ml。在純化bifidi

9、n I的過程中，為了獲得較高的回收率，本研究中采用了“三步走”的方法：第一步采用的是硅酸吸附解吸，得到的比活力為67696 AU/mg，回收率為80%；第二步采用的是陽離子交換層析，經(jīng)NaCl梯度洗脫后得到的產(chǎn)物比活力上升到115315 AU/mg，回收率為64%；而最后一步采用的反向高效液相色譜，主峰的保留時間在36.88 min。整個流程下來，bifidin I總的純化倍數(shù)為1390倍，得到的最終比活力為365714 AU/mg，總

10、回收率為25.6%。在此基礎(chǔ)上對純化產(chǎn)物進(jìn)行了Tricine-SDS-PAGE分析，純化后bifidin I的相對分子質(zhì)量約為3 kDa，在MALDI-TOF的檢測實驗中在2879.7 Da得到一個峰。將純化產(chǎn)物用Edman降解法對N端的蛋白序列進(jìn)行檢測，得到了NH2-Lys-Tyr-Gly- Ser-Val-Pro-Leu-Gly的高疏水序列，這與已報道陽離子抗菌肽的特征相似，但其氨基酸序列與Genebank已報道細(xì)菌素序列未有重疊，

11、說明它是一種新的乳酸菌細(xì)菌素，并從N端的NH2-Lys-Tyr判斷它有可能是屬于對李斯特菌具有特異抗菌特性的Ila類細(xì)菌素。
　　 最后對bifidin I的性質(zhì)進(jìn)行了考察，各類酶解實驗表明蛋白酶酶解可以讓bifidinI完全失活，而過氧化氫酶，α-淀粉酶和酯酶對其活力沒有影響；bifidin I的熱穩(wěn)定性很高，在121℃處理15分鐘，其活力沒有任何損失；其活性在pH4到pH10的范圍內(nèi)穩(wěn)定。根據(jù)bifidin I的分子量大小、

12、李斯特菌抗性及部分已知氨基酸序列可初步判斷它是一種未報道的細(xì)菌素，并基本可定義屬于第二類細(xì)菌素。在此基礎(chǔ)上對Bifidobacterium infantis BCRC14602進(jìn)行了質(zhì)粒消除實驗，該菌株經(jīng)過40μg/ml吖啶黃處理后可突變?yōu)锽if菌株，該突變株不產(chǎn)生bifidin I但是對bifidin I具有免疫性，由此可判斷Bifidin I的產(chǎn)生與Bifidobacterium infantis BCRC14602中的一個質(zhì)粒有關(guān)