牛腸道疾病的一種新病原鑒定

1、1,牛腹瀉類疾病概述,臨床上牛腸道疾病包括傳染性疾病和非傳染性疾病，病因復雜，是嚴重制約我國養(yǎng)牛業(yè)發(fā)展的一個重要的因素。由傳染性因素所致的牛腸道傳染病-腹瀉，其病原多樣，臨床上以嚴重腹瀉、脫水和高度死亡為特征。常見腹瀉類疾病主要有沙門氏菌病、大腸桿菌病、牛副結(jié)核病、牛彎曲菌病、球蟲病、隱孢子蟲病、牛病毒性腹瀉、牛細小病毒病、牛輪狀病毒病、牛冠狀病毒病等。,2,牛沙門氏菌病,流行病學：各種年齡，但幼齡更易感，以2～6周齡犢牛易感性最高

2、。妊娠可流產(chǎn)?；疾游锖蛶Ь呤侵饕獋魅驹础Ｒ荒晁募揪砂l(fā)生。呈散發(fā)或地方流行性。臨床癥狀急性型：突然發(fā)病、高熱（40～41℃）、精神沉郁、食欲廢絕、產(chǎn)奶量下降。不久即開始下痢，糞便呈水樣，惡臭，帶血或含有纖維素絮片。下痢開始后體溫降至正常或略高。病程持續(xù)4～7天。不經(jīng)治療或治療不當死亡率可高達75%，而經(jīng)治療后，死亡率可降至10%。病牛表現(xiàn)毒血癥癥狀，脫水、消瘦。持續(xù)10～14天糞便稀軟，一般需2個月才能完全康復。妊娠母牛感染后可

3、發(fā)生流產(chǎn)。犢牛 有些犢牛在生后48小時內(nèi)開始拒食、臥地，并迅速出現(xiàn)衰竭等癥狀，常于3～5天內(nèi)死亡。但多數(shù)犢牛則于10～14日齡后發(fā)病，體溫升高（40～41℃），24小時后排出灰黃色液狀糞便，并混有粘液和血絲，通常于發(fā)病后5～7天內(nèi)死亡，病死率可達50%。病期延長時，腕和跗關(guān)節(jié)可能腫大，有的還有支氣管炎和肺炎等癥狀。,3,牛大腸桿菌病,流行病學：病原存在于成年牛腸道和周圍環(huán)境。消化道傳染，也可經(jīng)臍帶感染。該病多見于初生犢牛，尤其2～3

4、日齡犢牛最為易感，故又成為犢牛白痢。臨床癥狀: 潛伏期短，一般為幾小時至十幾小時。敗血癥型 產(chǎn)后3天內(nèi)犢牛。病初體溫升高至40℃，食欲降低或廢絕，隨后腹瀉，很快脫水，數(shù)小時至1天內(nèi)因急性敗血癥死亡。病死率可達80％以上。病程稍長者，可能并發(fā)臍炎、關(guān)節(jié)炎或肺炎，幸存者生長發(fā)育受阻。腸毒血癥型 生后7天內(nèi)犢牛，通常不出現(xiàn)明顯癥狀突然死亡。有癥狀者則為典型中毒癥狀，如體溫正?；蛏愿?，初期興奮不安，隨后轉(zhuǎn)為沉郁甚至昏迷，然后進入瀕死

5、期。死前伴有劇烈腹瀉，排出白色而充滿氣泡的稀糞。腸炎型 7～10日齡犢牛，體溫升高、食欲減退、喜躺臥，下痢，糞便初呈黃色粥樣，隨后變?yōu)樗畼?、呈灰白色，并混有未消化的凝乳塊、血液、泡沫，有酸敗氣味。后期病犢排糞失禁，尾和后軀染有稀糞。病程長的，可能出現(xiàn)肺炎或關(guān)節(jié)炎。治療及時，一般可以治愈。如不及時治療，常因虛脫或繼發(fā)肺炎而死。個別病例也會自愈，但以后發(fā)育遲緩。,4,牛彎曲菌性腹瀉,流行病學：又名牛冬痢或黑痢，秋冬季節(jié)，出血性下痢。各品

6、種和年齡均可發(fā)病，一般成年牛發(fā)病較重，犢牛則較輕。地方流行性。病后可獲得一定的免疫力。臨床癥狀： 潛伏期為3～7天，突然發(fā)病，一夜間可蔓延20%牛群，2～3天可波及80%牛群。病牛排出惡臭水樣稀糞，常帶有血液。體溫、脈搏、呼吸、食欲正常。病情嚴重者，表現(xiàn)精神萎頓，食欲不振，弓背寒戰(zhàn)，虛弱無力。病程2～3天，治療及時，很少發(fā)生死亡。,5,牛副結(jié)核,流行病學：副結(jié)核分枝桿菌主要感染牛，特別幼年牛更易感染發(fā)病。病牛和隱性感染牛是傳染源，流行

7、特點是發(fā)展緩慢，病程長、發(fā)病率不高、病死率極高，一旦在牛群中出現(xiàn)則很難根除。懷孕、分娩、泌乳或營養(yǎng)缺乏等因素可促使發(fā)病。臨床癥狀：潛伏期長達6～12個月，甚至更長。有的幼年牛感染，到～5歲時才表現(xiàn)臨床癥狀。病初往往無明顯癥狀，以后癥狀逐漸明顯，出現(xiàn)間歇性腹瀉，逐漸變?yōu)榻?jīng)常性的頑固腹瀉。糞便稀薄，惡臭，可帶有氣泡、粘液和血液凝塊。早期食欲、精神都還正常，以后食欲減退，逐漸消瘦，眼窩下陷，經(jīng)常躺臥，不愿走動。皮膚粗糙，被毛粗亂，下頜及垂皮

8、水腫。體溫常無明顯變化。如給予多汁飼料可加重腹瀉癥狀。如腹瀉不止，一般經(jīng)3～4個月，最后因腹瀉衰竭而死?；疾∨Ｈ阂虮静〉乃劳雎士蛇_10%。,6,牛球蟲病,流行病學：各品種，2歲以內(nèi)犢牛發(fā)病率較高，死亡率20%～40%，而成年牛常呈隱性感染。一般多發(fā)生在4-9月份。潮濕多沼澤草場放牧牛群很易感染。冬季舍飼期間亦可能發(fā)病，主要由于飼料、墊草、母牛乳房被糞污染，使犢牛感染。牛群擁擠和圈舍衛(wèi)生條件差時會增加發(fā)病機會。不同地區(qū)，不同牛群的球蟲感染

9、率及發(fā)病率不同。臨床癥狀：多見于2歲內(nèi)犢牛，多急性，但也有慢性。急性病期，通常為10～15天，個別1～2天死亡。病初表現(xiàn)為精神沉郁，被毛松亂，糞便稀薄稍帶血液且具惡臭味。一周后，癥狀加劇，食欲廢絕，消瘦，精神萎靡，喜躺臥，體溫上升到40℃～42℃，瘤胃蠕動和反芻停止，排出帶血的稀糞，其中混有纖維素性假膜，惡臭。病末期糞便呈黑色，幾乎全是血液，體溫下降，在惡病質(zhì)狀態(tài)下死亡。慢性病例，病程長達數(shù)月，主要表現(xiàn)下痢和貧血，如不及時治療，亦

10、可發(fā)生死亡。,7,牛隱孢子蟲病,流行病學：糞-口途徑感染，宿主范圍廣泛；發(fā)病率很高但死亡率差別很大。100日齡以內(nèi)幼畜尤其4～30日齡犢牛最易感染。國外報道犢牛(4-17日齡左右)發(fā)病率達50%以上，國內(nèi)在北京、湖南、河南等省市調(diào)查的感染率為5.3%-40%，牛病程2～14天，死亡率16%～40%。臨床癥狀：食欲下降、腹瀉、脫水是本病的主要特征。若單獨感染腹瀉可持續(xù)7天以上，繼發(fā)感染或者混合感染則會出現(xiàn)脫水、酸堿失衡、腹瀉等。犢牛感染

11、最為嚴重，主要表現(xiàn)精神沉郁，厭食，腹瀉，糞便帶血和含大量纖維素；發(fā)育遲緩，進行性消瘦和減重甚至死亡。其中鼠隱孢子蟲可引起中等程度的腹瀉，小隱孢子蟲可引起水樣腹瀉。,8,牛輪狀病毒病,流行病學：1～7日齡內(nèi)新生犢牛?；疾游锖碗[性感染者是主要傳染源。污染的飼料、飲水、墊草及土壤等媒介經(jīng)口傳播。多發(fā)生在晚秋、冬季和早春。寒冷、潮濕、不良衛(wèi)生條件、劣質(zhì)飼料和其他疾病的等均對該病嚴重程度和病死率影響很大。臨床癥狀：最早病例見于生后12小時，最

12、遲也在數(shù)周以內(nèi)終止。人工感染潛伏期是18～24 小時。癥狀以突然腹瀉開始，病犢精神萎頓，體溫正?；蚵杂猩?。若體溫降至常溫以下則是死亡的征兆。厭食和腹瀉，糞便黃白色液狀，有時帶有粘液和血液。腹瀉時間延長，則脫水明顯。病死率可達10～50%，死亡的原因多是急性脫水或酸中毒。病程1～8天。若繼發(fā)感染大腸桿菌則預后不良，致死率增高。,,9,牛病毒性腹瀉-黏膜病,流行病學：各種年齡都易感、以幼齡牛易感性最高。病牛分泌物、排泄物、血液和脾臟等都含

13、有病毒，主要傳播途徑是消化道和呼吸道，也可經(jīng)胎盤垂直傳播。以冬春季節(jié)多發(fā)。新疫區(qū)急性病例多，病死率可達90%～100%，老疫區(qū)急性病例少，但隱性感染高達50%以上。臨床癥狀：潛伏期7～14天。臨床上牛群多數(shù)表現(xiàn)為隱性感染，但小牛癥狀嚴重。急性型 常見于幼犢，死亡率很高，腹瀉是特征性癥狀，可持續(xù)1～3周。稀糞呈水樣初期淡黃色，后期常伴有腸粘膜和血液，水樣、惡臭，有大量粘液和氣泡。體溫升高達40～42℃，流鼻汁、咳嗽、呼吸急促、流淚、

14、流涎、精神萎頓等，以后口腔粘膜發(fā)生糜爛或潰瘍持續(xù)4～7天，同時白血球減少。慢性型 出現(xiàn)間歇性腹瀉，病程較長，一般2～5個月，病牛被毛粗亂、消瘦，生長發(fā)育受阻，有的出現(xiàn)跛行。妊娠母牛常發(fā)生流產(chǎn)，或產(chǎn)下有先天性缺陷犢牛。最常見的缺陷是小腦發(fā)育不全。患犢表現(xiàn)輕度的共濟失調(diào)、完全不協(xié)調(diào)或不能站立。有些患牛失明。,10,牛冠狀病毒病,流行病學：多見于1～9日齡乳用犢牛，腸炎嚴重程度與犢牛日齡、免疫狀況、病毒毒株和感染劑量有關(guān)。常呈地方流行性

15、，發(fā)病牛場常在幾年內(nèi)連續(xù)發(fā)生。消化道和呼吸道是主要傳播途徑。飼養(yǎng)管理差、寒冷、潮濕可促使本病發(fā)生。臨床癥狀：潛伏期短，約為1d左右犢牛腹瀉主要見于7～10日齡，吃過初乳或未吃過初乳的犢牛均可發(fā)病，前者病情較輕。病初，患犢精神沉郁，吃奶減少或停止，排淡黃色的水樣糞便、內(nèi)含凝乳塊和黏液，嚴重的可出現(xiàn)發(fā)熱、脫水和血液濃縮。腹瀉持續(xù)3～6d，大部分犢?？煽祻停绺篂a嚴重、治療不適當可能死亡。若繼發(fā)細菌感染，死亡率可超過50％。成年奶?？砂l(fā)

16、生血痢，特征為突然發(fā)病，表現(xiàn)腹瀉，便如黑血樣，產(chǎn)奶量急劇下降，同時出現(xiàn)流鼻涕、咳嗽、精神沉郁和食欲不振，發(fā)病率可達50％～100％，但死亡率很低。,11,牛腸道病毒感染,流行病學：牛腸病毒廣泛存在自然界，主要流行腸病毒1型和2型。BEV-1宿主范圍包括人、馬、狗、牛、豬、兔、禽類、鹿、非洲羚羊、水牛、綿羊和山羊；BEV-2的宿主只有家養(yǎng)牛。在國外牛群中，牛腸病毒陽性率高達到17.6-80%。初生犢牛因飲用初乳導致抗體陽性率非常高。主要經(jīng)

17、過糞口途徑傳播。病毒在宿主的消化道中復制增殖。病毒對酸性環(huán)境耐受的特性使得病毒能在消化道中長期存活。感染動物糞便中存在相當高的滴度（105-1011/g）的病毒粒子。臨床癥狀：一般為隱性感染，下痢、肺炎、呼吸道癥狀和乳房炎較為常見。此外，繁殖障礙表現(xiàn)明顯，如子宮內(nèi)膜炎、不孕、流產(chǎn)和死胎。但大多數(shù)情況下，BEV一般為無癥狀感染，不會導致患畜健康嚴重受損。試驗感染時，動物表現(xiàn)為輕度下痢和輕微呼吸道癥狀。下痢表現(xiàn)為水樣腹瀉，有泡沫，少數(shù)嚴重

18、的還有鮮血。體溫變化不明顯，食欲下降，基本沒有死亡，但產(chǎn)奶量大幅下降。約兩周后康復，康復后大多數(shù)奶牛的產(chǎn)奶量不能恢復到病前的水平。,12,,牛腸病毒（Bovine Enterovirus）為小RNA病毒科成員。無囊膜，直徑為27-30nm。復制部位在胞漿，往往可見晶格樣排列的病毒顆粒。被黏膜或糞便包裹的病毒在通常的環(huán)境下對熱穩(wěn)定。對pH3及高鹽環(huán)境耐受，對消毒劑不敏感。,13,,近年來北京部分牛場的產(chǎn)奶牛普遍（約80%）出現(xiàn)嚴重腹瀉

19、癥狀：水樣腹瀉，有泡沫，少數(shù)（10-15%）嚴重病牛糞便含有鮮血，體溫變化不明顯，食欲下降，基本沒有死亡，但產(chǎn)奶量大幅下降（約30%）。病程兩周左右，康復后大多數(shù)奶牛產(chǎn)奶量難以恢復到病前水平，特別是高產(chǎn)奶牛。據(jù)回顧性調(diào)查，該病兩年發(fā)生一次。發(fā)病牛場采樣分離到了一種牛腸道病毒。,14,目的意義,本研究通過從臨床上嚴重腹瀉、血性下痢病牛直腸拭子中分離的一株牛腸道病毒2型分離株鑒定過程，介紹一種基于隨機PCR 的未知病毒鑒定方法，為后期未知

20、病原體分離鑒定奠定基礎(chǔ)，同時也為牛腸病毒2型感染的診斷和控制提供了科學依據(jù)。,15,病料采集和病毒分離,采集病牛直腸拭子，按常規(guī)方法處理備用。培養(yǎng)MDBK細胞，待細胞單層生長至80%以上時，將處理后的病料接種到MDBK，37℃作用1h，棄病毒液，加含1%FBS的DMEM，于5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)觀察記錄細胞狀況，當出現(xiàn)細胞病變（CPE）時收獲病毒液，并連傳3代制備毒種。,16,正常細胞形態(tài)及感染后不同時間點的細胞病變,正常細胞,16h,

21、36h,8h,病毒分離結(jié)果,× 400,17,,1、 蝕斑純化和病毒增殖 利用MDBK細胞，按照蝕斑純化常規(guī)方法，將分離物進行純化。將經(jīng)過三次純化的未知病毒再次接種細胞單層，37℃作用1h，棄病毒液，加含1%FBS的DMEM，于5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)觀察記錄細胞病變（CPE）。至CPE出現(xiàn)90%左右，收獲病毒液。連續(xù)傳毒3代后大規(guī)模增殖病毒。 2 、牛腎細胞（MDBK）TCID50測定

22、 在96孔細胞培養(yǎng)板上培養(yǎng)BK細胞至單層后，吸棄培養(yǎng)液，分別接種增殖后的原液細胞毒和10-1~10-7稀釋病毒液，病毒稀釋液為基礎(chǔ)培養(yǎng)基。對照組用基礎(chǔ)培養(yǎng)基代替病毒液。每孔100µl，每組10孔，于CO2培養(yǎng)箱孵育1h。吸棄接種液，每孔加125 µl DMEM維持液，于CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)3d，觀察細胞病變情況。,,18,,1、病毒濃縮 在收集到的病毒上清中加入5％的PEG 6000，4 ℃攪拌過

23、夜（約18 h）。4 ℃ 10000 rpm離心1.5 h，棄上清。沉淀用TNMC緩沖液（50 mM Tris-HCl，pH 7.5，100 mM NaCl，10 mM CaCl2，1mM MgCl2）懸浮，于4 ℃ 50000 rpm離心1 h，棄上清。沉淀用TNMC緩沖液重新懸浮，使其終體積為濃縮前的1%。 2、病毒提純 在25℃下將CsCl配制成10%、20%、30%、40%、50%、60%密度梯度

24、的勻漿液，用注射器小心吸取濃度最小的溶液加入離心管底，然后將注射器針頭插入離心管底部依次加入較高的各個濃度（10%-60%），每個濃度500 µl。在離心管頂部加入1ml病毒液。水平轉(zhuǎn)頭4℃ 50000 rpm，離心24 h。收集離心后形成的各區(qū)帶，用TNMC緩沖液稀釋10或15倍，4℃ 50000 rpm離心1.5 h，以去除殘余CsCl。,,19,病毒提純結(jié)果,未知病毒細胞毒TCID50=10-4.05/0.1ml。病毒

25、液經(jīng)過增殖、濃縮、氯化銫密度梯度離心，獲得4條區(qū)帶。,,,,,,20,病毒的理化特性鑒定,,,,電鏡照片,1,,,,耐酸性試驗,4,,,胰蛋白酶敏感性試驗,5,,,耐熱性試驗,6,,,脂溶劑敏感性試驗,3,21,電鏡樣品制備方法,將未知病毒液接種已長成單層的MDBK細胞，并以維持液維持；16h后將細胞培養(yǎng)基棄去，用PBS（pH7.2， 0.1M）輕輕洗滌一遍；以0.25％的胰酶消化細胞，使之成為單細胞懸液；1000-3000rpm離心1

26、0min，棄去上清；以2.5％的戊二醛(PH7．4)前固定。用刮匙將樣品取出并割成小塊，PBS（pH7.2， 0.1M）洗滌20min；1%鋨酸固定；PBS（pH7.2， 0.1M）洗滌20min；丙酮脫水（梯度30%，50%，70%，80%，90%，100%）每個梯度20min，脫三遍；環(huán)氧樹脂包埋聚合；切片機超薄切片，醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛雙染色；透射電鏡觀察病毒粒子形態(tài)。,22,,,,,,,電鏡形態(tài)觀察,電鏡形態(tài)觀察結(jié)果,電鏡照片圖

27、組,1,電鏡照片圖組,2,23,病毒核酸型鑒定,DNA抑制劑如5-氟尿嘧啶等進入細胞后發(fā)生磷酸化，參與新合成的DNA以代替胸腺嘧啶，產(chǎn)生無功能的分子，從而抑制DNA的合成，將此藥物加于細胞培養(yǎng)物中，對DNA病毒有明顯的抑制作用，而對RNA病毒沒有或僅有極低的抑制作用。,,24,病毒核酸型鑒定試驗方法,在6孔板內(nèi)培養(yǎng)細胞至單層，稀釋病毒液，使其分別為100~10-5六個稀釋度。向1-6號板中分別加入100、10-1、10-2、10-3、1

28、0-4、10-5六個滴度的病毒液，7號板加入DMEM（病毒稀釋液），每孔500 µl。在37℃ CO2培養(yǎng)箱中孵育1h。用PBS洗滌6孔板，每塊板的三個孔加入含50 µg/ml 5-氟尿嘧啶的1%FBS DMEM維持液，另三個孔加入不含5-氟尿嘧啶的1%FBS DMEM維持液。置于37℃ CO2培養(yǎng)箱中孵育3d。按時觀察細胞病變。,,25,病毒核酸型鑒定試驗結(jié)果,接毒后隨著時間的推移，1-6號板接毒孔相繼出現(xiàn)細胞病

29、變，病變程度隨著稀釋倍數(shù)增大而減弱，6號板細胞病變不明顯。每塊6孔板（接種同一稀釋度病毒液）中，添加含5-氟尿嘧啶的維持培養(yǎng)液孔與不添加5-氟尿嘧啶的維持培養(yǎng)液孔相比，細胞病變出現(xiàn)時間及病變程度無顯著差異。7號板（不接病毒）中，所有培養(yǎng)孔均未出現(xiàn)細胞病變。根據(jù)5-氟尿嘧啶對未知病毒的抑制滴度小于一個對數(shù)，可以判定未知病毒對DNA抑制劑不敏感，為RNA病毒。,,26,脂溶劑敏感性試驗,某些病毒具有囊膜，脂質(zhì)是其重要的結(jié)構(gòu)成分，應用乙醚

30、等有機溶劑除去脂質(zhì)，將使這類病毒滅活，例如皰疹病毒、正粘病毒、副粘病毒和批膜病毒等。故脂溶劑敏感試驗可檢測出病毒是否具有囊膜。,,27,脂溶劑敏感性試驗方法,于病毒液中加入AR級氯仿，使其終濃度為4.8%，置4℃振蕩混合10min。500rpm離心沉淀5min，吸取上層液體，滴定病毒感染力。另外，以加入4.8%量PBS的病毒液作為對照，同樣處理和滴定。氯仿處理病毒液的滴度比對照病毒液下降2個對數(shù)以上者，判斷對氯仿敏感。滴度相差小于1個對

31、數(shù)者，判為對氯仿不敏感。,,28,脂溶劑敏感性試驗結(jié)果,將病毒經(jīng)過氯仿處理后接種MDBK細胞， 細胞毒TCID50=10-4.02/0.1ml。與未用氯仿處理的病毒的TCID50（10-4.05/0.1ml）相比，二者滴度相差小于一個對數(shù)，故判定未知病毒對氯仿不敏感，為無囊膜病毒。,,29,耐酸性試驗,某些病毒耐酸，例如小RNA病毒科中的腸道病毒，但同科中鼻病毒和口蹄疫病毒卻對酸敏感。因此耐酸性試驗也是病毒鑒定上一個比較重要的項目。,

32、,30,耐酸性試驗方法,將病毒液等量分裝于15ml離心管中。用0.1N的HCl將小瓶中的病毒液的pH調(diào)至3.0，并向另1個離心管內(nèi)的病毒液加入相同于用酸量的滅菌的PBS做對照。置于37℃的恒溫水浴鍋或者室溫感作1h，再用5.6%NaHCO3溶液將PH調(diào)回至7.2左右。此后將兩瓶病毒液分別用敏感細胞測定感染力。如果試驗組感染力比對照組感染力降低2個對數(shù)以上乃至完全滅活者，則證明該病毒對酸敏感。滴度相差小于1個對數(shù)者為耐酸。,,31,耐酸性

33、試驗結(jié)果,將病毒液經(jīng)過HCl處理，再用NaCO3將pH調(diào)回至7.2后接種MDBK細胞，細胞毒TCID50=10-4.17/0.1ml。與用等量PBS處理的對照組TCID50（10-3.77/0.1ml）相比，二者滴度相差小于一個對數(shù)，故判定未知病毒對pH3環(huán)境耐受。,32,胰蛋白酶敏感性試驗,灰質(zhì)炎病毒、豬傳染性胃腸炎冠狀病毒等對胰蛋白酶具有較高的抵抗力。相反，某些病毒，例如痘病毒、呼腸孤病毒和皰疹病毒等卻易被胰蛋白酶滅活。因此，胰蛋

34、白酶試驗也常用于一些病毒的鑒定。,,33,胰蛋白酶敏感性試驗方法,于滅菌15ml離心管內(nèi)，加入病毒液500µl，再加入溶于pH7.4PBS的1%胰蛋白酶溶液500 µl，使胰蛋白酶終濃度為0.5%，充分混合。置37℃作用1h，隨即加入滅活的犢牛血清4ml，充分混合，終止胰蛋白酶的作用。另取同樣的病毒液500 µl，加入pH7.4PBS液500 µl，混合和37℃放置1h后，加入滅活犢牛血清4ml作

35、為對照。最后將上述兩份混合液分別在BK細胞測定感染力。感染力比對照組降低2個對數(shù)以上，以至完全喪失感染力者，判為對胰蛋白酶敏感；滴度相差小于1個對數(shù)者，判為對胰蛋白酶抵抗。,,34,胰蛋白酶敏感性試驗結(jié)果,將病毒經(jīng)過胰蛋白酶處理后接種MDBK細胞，細胞毒TCID50=10-3.06/0.1ml。與用等量PBS處理的對照組TCID50（10-3.17/0.1ml）相比，二者滴度相差小于一個對數(shù)，故判定未知病毒對胰蛋白酶不敏感。,,35,

36、耐熱性試驗,不同病毒對不同溫度的敏感度以及耐受時間不同，故可以通過熱敏感性試驗及結(jié)合二價陽離子保護性試驗（二價陽離子例如MgCl2，能夠明顯提高某些病毒對50-55 ℃高溫處理的抵抗力）對病毒進行鑒定。,,36,耐熱性試驗方法,1、對不同溫度的耐受 將病毒懸液分為等量4管，分別置于50℃、60℃、70℃、80℃水浴1h，測定感染力。如果在某個溫度下試驗組感染力比對照組感染力降低2個對數(shù)以上乃至完全滅活者，則證明該病毒對

37、此溫度敏感。滴度相差小于1個對數(shù)者為耐受。 2、對50℃的耐受時間 將病毒懸液分為等量4管，置于50℃水浴分別感作5、10、15和30min，隨后測定感染力。如果試驗組感染力比對照組感染力降低2個對數(shù)以上乃至完全滅活者，則證明該病毒在此時間內(nèi)對50℃敏感。滴度相差小于1個對數(shù)者表明病毒在此時間內(nèi)對50℃耐受。,,37,耐熱性試驗方法,3、二價陽離子保護性試驗 將MgCl2用蒸餾水配

38、成1.1M溶液。另將病毒液分成兩份，分別用1.1M MgCl2溶液和生理鹽水（對照）作10×稀釋，置50℃水浴感作1h后，在細胞培養(yǎng)物上滴定感染力，如果試驗組感染力比對照組感染力提高2個對數(shù)以上，則證明MgCl2對病毒具備保護性。滴度相差小于1個對數(shù)者為不具有保護性。,,38,耐熱性試驗結(jié)果,1、對不同溫度的耐受 分別將經(jīng)過50℃、60℃、70℃、80℃處理1h的病毒，接種BK細胞，3天后觀察均不引起細胞病變

39、，由此可知50℃作用1h便可滅活病毒。 2、對50℃的耐受時間 分別將經(jīng)過50℃處理5min、15min、30min、1h的病毒，接種BK細胞，3天后觀察均不引起細胞病變。由此可知，50℃作用5min便可滅活裸露狀態(tài)的病毒。,,39,耐熱性試驗結(jié)果,3、二價陽離子保護性試驗 將MgCl2溶液處理的病毒液置于50℃水浴1h后接種MDBK細胞，細胞毒TCID50=10-5.06/0.1ml。

40、 與未使用MgCl2溶液且經(jīng)過同樣高溫處理的病毒（完全滅活）相比較，可以判定MgCl2溶液對處于50℃高溫環(huán)境中的未知病毒具有保護力。,,40,理化特性鑒定總結(jié),病毒核酸型鑒定——RNA（抑制滴度小于一個對數(shù) ）脂溶劑敏感試驗——無囊膜（TCID50：10-4.02/0.1ml VS 10-4.05/0.1ml） 胰酶敏感試驗——不敏感（TCID50：10-3.06/0.1ml VS 10-3.17/0.1ml） 耐

41、酸性試驗——pH3耐受（TCID50：10-4.17/0.1ml VS 10-3.77/0.1ml） 耐熱性試驗 —— 50℃作用5min滅活（TCID50：100/0.1ml VS 10-4.05/0.1ml） ——二價陽離子具有保護力（TCID50：10-5.06/0.1ml VS 100/0.1ml）,,41,排除可疑病毒,結(jié)合病牛癥狀及病毒核酸型，對描述相符的一些常見病毒進行檢測排除?？梢圆捎醚鍖W試驗、PCR檢

42、測等方法。,42,可疑病毒排除試驗方法,根據(jù)病毒引起牛腹瀉的臨床癥狀及核酸型判定結(jié)果，懷疑其可能為BVDV（病毒性腹瀉病毒）、BCV（牛冠狀病毒）、BRV（牛輪狀病毒）感染。故合成這三種病毒的特異性引物對病毒進行擴增。引物序列如下： （1）BVDV引物 FBVDV：5’-CAT GCC CAT AGT AGG AC-3’ RBVDV：5’-CCA TGT GCC ATG TAC AG-3’ （2）輪狀病毒引物

43、 FBCV：5’-AgA ATT TCC gTT Tgg CTA-3’ RBCV：5’-Cgg TCA CAT CAT ACA ACT CT-3’ （3）冠狀病毒引物 FBCV：5’-gAg CgT CCT TTg gAA ATC gT-3’ RBCV：5’-gCT TAg TTA CTT gCT gTg gC-3’,43,,用BVDV、BCV、BRV特異性引物對未知病毒RT-PCR擴增結(jié)果

44、 1. 用BVDV特異性引物對BVDV病毒株擴增產(chǎn)物（陽性對照） 2. 用BVDV特異性引物對未知病毒擴增產(chǎn)物 3. 用BCV特異性引物對未知病毒擴增產(chǎn)物 4. 用BRV特異性引物對未知病毒擴增產(chǎn)物 M. DNA分子量標準,可疑病毒排除結(jié)果（PCR檢測）,,,,擴增結(jié)果顯

45、示，可以排除此病毒為BVDV、BCV及BRV。,44,分子生物學檢測方法,提取RNA（據(jù)理化鑒定結(jié)果）使用隨機引物進行PCR或者RT-PCR回收目的片段連接T載體轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞藍白斑篩選重組質(zhì)粒測序序列比對分析,45,隨機引物選擇,隨機引物PCR技術(shù)(random amplied poly morphic DNA，RAPD；arbitranly primed PCR，AP PCR)是由Welsh、Williams于1990年

46、幾乎同時建立起來的一項DNA多態(tài)檢測技術(shù)。該技術(shù)以PCR為基礎(chǔ)，利用一系列單一的人工合成的隨機寡核苷酸鏈為引物，對所研究的基因組DNA進行PCR擴增。這一技術(shù)在物種鑒定、動植物分類、群體遺傳學調(diào)查、遺傳性突變基因的篩查、新病毒發(fā)現(xiàn)等方面得到廣泛的應用。 本次試驗選擇錨定隨機引物序列如下： RPAdP：5’-ggA CTg gCT CgA Tgg CTC NNN NNN N-3’ RPAP： 5’-

47、ggA CTg gCT CgA Tgg CTC -3’,分子生物學檢測,46,,1. 用錨定隨機引物對病毒提純后區(qū)帶1的擴增產(chǎn)物 2. 用錨定隨機引物對病毒提純后區(qū)帶2的擴增產(chǎn)物 3. 用錨定隨機引物對病毒提純后區(qū)帶3的擴增產(chǎn)物 4. 用錨定隨機引物對病毒提純后區(qū)帶4的擴增產(chǎn)物

48、 M.DNA分子量標準,,回收500bp以上的條帶,錨定隨機引物擴增結(jié)果,電泳圖顯示，模板經(jīng)隨機引物擴增后其片段大小從幾百至幾千個堿基對不等，產(chǎn)物呈彗尾樣拖帶現(xiàn)象。,47,用錨定隨機引物對重組質(zhì)粒的PCR鑒定結(jié)果,,回收目的片段連接T載體轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞藍白斑篩選重組質(zhì)粒,48,重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定結(jié)果,,,49,,選擇部分酶切鑒定為陽性的質(zhì)粒送至公司測序，測序結(jié)果登陸NCBI進行比對。結(jié)果表明， 其與Bovine Enter

49、ovirus 同源性為68%-78%。其中，與Bovine Enterovirus type 2 strain 3A （complete genome ）同源性最高。 根據(jù)上述結(jié)果，懷疑此病毒可能為BEV-2，故設(shè)計合成特異性引物對其進行擴增。 引物序列如下： BEV-2-F：5’-ACg gAg TAg Atg gTA TTC CC-3’ B

50、EV-2-R： 5’-CgA gCC CCA TCT TCC AgA g-3’ 目的片段約220bp左右。,,序列比對結(jié)果,50,,1-4. 用BEV-2特異性引物對病毒提純后區(qū)帶1至區(qū)帶4的擴增產(chǎn)物 5. 用BEV-2特異性引物對未提純病毒的擴增產(chǎn)物 M. DNA分子量標準,特異性引物擴增結(jié)果,51,,用特異性引物擴增產(chǎn)物序列比對結(jié)果表明，其與Bovine E

51、nterovirus type2 同源性為80%-93%。其中，與Bovine enterovirus type 2 strain Wye 8844 5' UTR同源性最高。,序列比對結(jié)果,,,,,,52,結(jié)論,病毒特性檢測結(jié)果與牛腸病毒2型的各項理化特性相符。分子生物學檢測結(jié)果表明，該病毒與牛腸病毒2型分離株同源性高達93%。結(jié)合以上二者判定未知病毒屬于牛腸病毒2型。,53,工作正在進行中,血清學檢測方法建立血清流行病