溫腎益氣顆粒對慢性阻塞性肺疾病大鼠氣道重構(gòu)的干預(yù)及對VEGF-A表達(dá)影響的實驗研究.pdf

1、研究背景：
　　慢性阻塞性肺疾?。–OPD）作為一種常見的慢性呼吸系統(tǒng)疾病，近年來其發(fā)病率和致殘率日益上升，嚴(yán)重危害人類的健康，居全球死亡原因的第4位。COPD的特征是氣流受限，而且氣流受限不完全可逆、呈進行性發(fā)展，其發(fā)病與肺部對有害氣體或有害顆粒的異常炎癥反應(yīng)有關(guān)。反復(fù)慢性炎癥刺激、損傷及不完全性修復(fù)導(dǎo)致氣道結(jié)構(gòu)和功能的異常，平滑肌細(xì)胞增生、肥大，成纖維細(xì)胞增殖，膠原和氨基聚糖沉積，杯狀細(xì)胞和黏液腺增生肥大且分泌旺盛等，進而引起

2、氣道重構(gòu)，而氣道炎癥、氣道重構(gòu)將會促進氣流受限的不斷進展，而且難以逆轉(zhuǎn)。深入探索氣道重構(gòu)的具體病理生理機制，設(shè)法阻斷 COPD病變持續(xù)進展的這一關(guān)鍵鏈，已成為研究防治 COPD的熱點。隨著研究的深入開展，發(fā)現(xiàn)肺血管內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、肺泡巨噬細(xì)胞和肺泡Ⅱ型細(xì)胞等均可合成、分泌或表達(dá)一種或多種生長因子，這些生長因子在分子水平上影響平滑肌細(xì)胞增殖和細(xì)胞外基質(zhì)沉積，它們所發(fā)揮的作用正日益受到關(guān)注。近年來國內(nèi)外開始探索血管內(nèi)皮生長

3、因子（VEGF）在COPD氣道重構(gòu)和血管重構(gòu)中的作用。
　　對于氣道重構(gòu)的防治，至今尚缺乏安全有效的藥物。中醫(yī)藥多途徑、多環(huán)節(jié)、多靶點治療特色決定了其在防治COPD氣道重構(gòu)方面具有獨特優(yōu)勢。經(jīng)過二十多年臨床實踐與應(yīng)用，證明具有溫腎益氣、清熱活血功效的名老中醫(yī)經(jīng)驗方——“溫腎益氣顆?！?，確能改善COPD病人臨床癥狀，減少急性發(fā)作次數(shù)。溫腎益氣顆粒是否具有調(diào)節(jié)VEGF在支氣管肺組織中的表達(dá)，進而干預(yù)氣道重構(gòu)的作用，有必要作進一步的研究

4、。為此，首先需要建立一個理想的動物模型，目前比較公認(rèn)的是慢性煙熏聯(lián)合氣道內(nèi)滴入脂多糖（LPS）雙因素造模法。這種造模方法能夠比較理想地構(gòu)建具有氣道重構(gòu)現(xiàn)象的、與人類發(fā)病較為相符的COPD動物模型。
　　研究目的：
　　在建立具有氣道重構(gòu)現(xiàn)象的 COPD大鼠模型的同時，觀察溫腎益氣顆粒對 COPD大鼠模型氣道重構(gòu)的干預(yù)作用以及對VEGF-A表達(dá)的影響，以深入探討名老中醫(yī)經(jīng)驗方的作用機制，為進一步推廣該中藥制劑提供實驗依據(jù)。

5、r>　　研究方法：
　　1.將50只健康雄性SD大鼠（清潔級），體重150±20g，隨機分為5組，即正常對照組、模型組、溫腎益氣顆粒高、中、低劑量治療組，每組10只。
　　2.模型組、溫腎益氣顆粒高、中、低劑量治療組煙熏10周，分別于造模第1、28天每只大鼠氣道內(nèi)滴入內(nèi)毒素脂多糖（LPS）200μg。
　　3.溫腎益氣顆粒高、中、低劑量治療組同時從造模第29天開始胃飼受試藥物至第70天結(jié)束，用量依次分別為8.4g/kg

6、、4.2g/kg、2.1g/kg。
　　4.取右下葉肺組織用10％中性緩沖甲醛液固定，分別行HE染色，Masson三色染色和免疫組化檢測。運用病理圖像分析儀軟件，測量基底膜周長、細(xì)支氣管總面積、細(xì)支氣管腔面積、單位面積平均肺泡數(shù)、平均肺泡面積，測定氣道壁膠原的面積，測定VEGF在大鼠支氣管壁的陽性表達(dá)強度和表達(dá)面積。
　　5.右肺中葉予提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）檢測VEGF-AmRNA的表達(dá)量。

7、>　　6.采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件分析處理實驗數(shù)據(jù)。
　　結(jié)果：
　　1.模型組動物體重增長與正常對照組比較明顯減緩，溫腎益氣顆粒高、中、低劑量治療組對COPD大鼠體重增長均無明顯作用。
　　2.光鏡下模型組可見細(xì)支氣管纖毛粘連倒伏，部分上皮細(xì)胞剝脫、變性壞死，杯狀上皮細(xì)胞增生，且氣管粘膜下層、肌層出現(xiàn)不同程度的淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等浸潤現(xiàn)象；細(xì)支氣管管壁增厚，肺泡管呈囊狀擴張，肺泡間隔斷裂，肺泡腔明顯不規(guī)則膨大。溫

8、腎益氣顆粒高、中、低劑量治療組與模型組比較單位面積平均肺泡數(shù)明顯增加而平均肺泡面積明顯減小，但仍與正常對照組有顯著差異，治療組各組間未見明顯差別。溫腎益氣顆粒高、中劑量治療組能明顯減輕炎癥細(xì)胞浸潤，且對小氣道壁的增厚有明顯抑制作用，但低劑量治療組對小氣道壁增厚未見明顯抑制作用，炎癥細(xì)胞浸潤亦未見明顯減輕。
　　3. Masson染色見模型組細(xì)支氣管壁膠原較正常對照組明顯增多，溫腎益氣顆粒高劑量治療組則可明顯抑制小氣道壁膠原的增加，

9、但中、低劑量治療組未見明顯的抑制作用。免疫組化顯示模型組支氣管壁VEGF蛋白高表達(dá)，明顯高于正常對照組。溫腎益氣顆粒高、中、低劑量治療組支氣管壁VEGF蛋白表達(dá)均明顯低于模型組，但均高于正常對照組，各組之間未見明顯差別。
　　4.模型組支氣管肺組織VEGF-A mRNA表達(dá)顯著增高。溫腎益氣顆粒高、中、低劑量干預(yù)治療后VEGF-A mRNA表達(dá)明顯降低，各組間干預(yù)效果無明顯差別。與正常對照組比較，溫腎益氣顆粒高、中、低劑量治療組V

10、EGF-A mRNA表達(dá)明顯增高。
　　結(jié)論：
　　1.慢性煙熏聯(lián)合氣道內(nèi)滴入 LPS雙因素造模法能夠較好地復(fù)制出具有氣道重構(gòu)特點的COPD動物模型。
　　2. VEGF-A的高表達(dá)可能參與了COPD大鼠的氣道重構(gòu)過程，研究其調(diào)控過程將有助于探索COPD復(fù)雜的發(fā)病機制。
　　3.中藥溫腎益氣顆粒可以減輕氣道重構(gòu)，其機制可能與調(diào)節(jié) VEGF-A在氣道的表達(dá)有關(guān)。
　　4.溫腎益氣顆粒不同劑量之間未能顯示出明確