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文檔簡介
1、研究目的:
通過建立COPD小鼠模型,檢測益氣化痰方對不同組別小鼠血漿、BALF和肺組織中TNF-α、IL-17、Muc5ac的表達水平,探討益氣化痰方對小鼠肺組織MAPK和NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路活化的影響及Muc5ac和AQP5 mRNA的基因表達影響,研究益氣化痰方對氣道炎癥、黏液分泌調(diào)節(jié)作用的機制。從分子生物學(xué)層面闡釋中醫(yī)學(xué)理論“肺主氣-益氣”,“肺主通調(diào)水道-化痰”以及益氣、化痰治則的內(nèi)在關(guān)系,從而為COPD中醫(yī)治療提
2、供實驗依據(jù)和參考。
研究方法:
1.選用健康雄性C57BL小鼠60只,隨機數(shù)字法分成6組:分別是正常對照組,COPD模型組,低劑量中藥組,中劑量中藥組,高劑量中藥組,地塞米松組。每組10只。采用香煙煙熏方法建立慢性阻塞性肺疾病小鼠模型,從小鼠一般情況、肺組織病理形態(tài)學(xué)(肺組織肉眼觀察、HE染色病理切片)觀察以及BALF細胞組成及細胞總數(shù)三個指標(biāo)評價慢性阻塞性肺病小鼠模型以及益氣化痰方對慢性阻塞性肺病小鼠炎癥細胞水平和
3、病理改變的影響;
2.采用WBP全身體積記錄儀在造模的第20周對各組小鼠進行無創(chuàng)肺功能檢查,記錄PIF、PEF和MV。了解動物模型的氣道阻力和肺順應(yīng)性情況,探討實驗動物模型的可靠性。
3.采用免疫組織化學(xué)方法檢測模型小鼠肺組織內(nèi)TNF-α、IL-17、Muc5ac的表達。比較分析益氣化痰方對肺組織內(nèi)細胞因子的表達的影響,研究益氣化痰中藥對COPD小鼠的治療作用。
4.應(yīng)用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELI
4、SA)檢測模型小鼠血漿和BALF中TNF-α、IL-17含量和BALF中Muc5ac含量。探討益氣化痰方對模型小鼠抗炎、抑制黏蛋白分泌的作用機制。
5.應(yīng)用RT-PCR方法檢測模型小鼠肺組織Muc5ac和AQP5 mRNA的基因表達情況。分析益氣化痰方對其表達水平的影響,從炎癥/免疫反應(yīng)介質(zhì)角度評價不同劑量組的藥效及其作用靶點。
6.采用Western blot方法檢測肺組織p38-MARK、Erk、JNK和NF-κ
5、B磷酸化的蛋白含量。分析益氣化痰方對COPD小鼠肺組織MAPK和NF-κB信號通路的影響,進一步證明益氣化痰方是通過IL-17/MAPK、NF-κB信號通路調(diào)控氣道炎癥反應(yīng),改變氣道上皮Muc5ac mRNA和AQP5表達。
7.實驗數(shù)據(jù)用(x)±s表示,采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件包進行統(tǒng)計分析。不同組間采用one-way ANOVA進行方差分析,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義,以P<0.01為顯著性統(tǒng)計學(xué)意義。
6、 研究結(jié)果:
1.益氣化痰方對COPD小鼠各指標(biāo)的影響
1.1組織形態(tài)學(xué)觀察HE染色后鏡下觀察,結(jié)果顯示:正常對照組小鼠的肺組織內(nèi),支氣管粘膜上皮及肺泡結(jié)構(gòu)完整,支氣管管腔內(nèi)纖毛排列整齊,未見有明顯的分泌物,管壁未見增厚,粘膜下層未見有明顯的炎癥細胞浸潤,肺泡腔未見有明顯的擴張。模型組小鼠的肺組織內(nèi),支氣管上皮細胞排列紊亂,柱狀上皮細胞脫落嚴重,杯狀細胞數(shù)量增多,纖毛少量倒伏脫落,不整齊排列,支氣管管壁增厚,管腔變形
7、狹窄,粘膜下腺體明顯增生,伴有大量的炎癥細胞浸潤,以中性粒細胞、單核巨噬細胞和淋巴細胞為主。肺泡壁變薄或斷裂,肺泡腔增大,部分融合成肺大皰,導(dǎo)致肺泡的數(shù)量明顯減少,肺間質(zhì)和肺泡腔內(nèi)可見大量的炎癥細胞浸潤。
1.2肺組織切片觀察PAS染色可以將肺組織中粘液染成紫紅色。正常對照組小鼠肺內(nèi)支氣管內(nèi)粘液較少,PAS染色陽性細胞的比例也比較低,而模型組小鼠肺組織內(nèi)支氣管內(nèi)粘液明顯增多,PAS染色細胞的數(shù)量也明顯增多。
1.3肺
8、功能指標(biāo)改變采用WBP全身體積記錄儀在造模的第20周對各組小鼠進行無創(chuàng)的肺功能檢查。結(jié)果發(fā)現(xiàn),與正常對照組小鼠相比,模型組小鼠PIF、PEF和MV數(shù)值顯著下降(P<0.01),符合COPD的臨床肺功能特點。高、中、低劑量的益氣化痰方均能明顯改善COPD小鼠氣道的高反應(yīng)狀態(tài)(P<0.05),改善作用同劑量呈現(xiàn)一定的依賴關(guān)系,高劑量的益氣化痰方改善作用最強,但各項指標(biāo)數(shù)據(jù)仍低于正常對照組小鼠,中劑量的益氣化痰方的改善作用次之,低劑量益氣化痰
9、方的改善作用較弱,而地塞米松組氣道阻力沒有明顯的改善作用(P>0.05)。
1.4 BALF細胞組成及細胞總數(shù)的變化研究顯示COPD模型組的總白細胞計數(shù)值最高,與正常組相比有顯著性差異(P>0.05),益氣化痰中藥高、中、低劑量組與模型組比較有顯著性差異(P<0.05或P<0.01),說明益氣化痰中藥對COPD大鼠炎癥細胞有明顯的抑制效果;在細胞分類計數(shù)中,各組均以單核巨噬細胞為主,與正常對照組比較,模型組單核巨噬細胞百分比顯
10、著降低(P<0.01),而淋巴細胞、中性粒細胞百分比均顯著增加(P<0.01),與模型組比較,益氣化痰中藥高、中、低劑量組單核巨噬細胞顯著增加(P<0.01或P<0.05),淋巴細胞、中性粒細胞、百分比顯著降低(P<0.01或P<0.05),提示香煙煙霧造模能誘導(dǎo)小鼠單核巨噬細胞百分比降低、淋巴細胞、中性粒細胞百分比升高,而益氣化痰方能明顯地升高COPD小鼠的單核巨噬細胞百分比,降低淋巴細胞、中性粒細胞的百分比,對COPD小鼠炎癥細胞的
11、抑制分泌作用明顯;不同劑量益氣化痰中藥對實驗小鼠炎癥細胞的影響具有明顯的量效關(guān)系。高、中、低劑量益氣化痰方對IL-17介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)有抑制作用,其中地塞米松組BALF中的炎癥細胞數(shù)量明顯減少,高劑量中藥組次之,緊接著是中劑量組,低劑量組小鼠BALF中的炎癥細胞數(shù)量減少最不明顯。
2.益氣化痰方對實驗小鼠TNF-α、IL-17、Muc5ac表達的影響
2.1 COPD小鼠肺組織內(nèi)TNF-α、IL-17、Muc5ac的表
12、達的變化免疫組化檢測結(jié)果顯示,IL-17、TNF-α、Muc5ac在正常小鼠肺組織呈弱陽性表達。而在COPD模型組小鼠肺組織內(nèi),IL-17、TNF-α、Muc5ac呈強陽性表達。提示IL-17可協(xié)同活化的巨噬細胞產(chǎn)生TNF-α,促進TNF-α誘導(dǎo)的多種中性粒細胞趨化,放大炎癥反應(yīng),使粘液分泌增加。激素可以阻斷或者抑制這種炎癥趨化因子表達,實驗也證明地塞米松也能明顯降低COPD小鼠肺組織內(nèi)TNF-α和IL-17的表達。
2.2
13、COPD小鼠血漿和BALF中TNF-α、IL-17含量的變化ELISA結(jié)果顯示,正常小鼠血漿和BALF與COPD模型組中血漿和BALF相比TNF-α的含量有顯著統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.01);正常小鼠血漿和BALF與COPD模型通過IL-17募集中性粒細胞分泌炎性介質(zhì),誘導(dǎo)產(chǎn)生的各種趨化因子,使炎癥細胞到達靶部位。與COPD小鼠模型組比較,益氣化痰中藥高、中、低劑量組血漿和BALF中TNF-α和IL-17的含量逐漸降低,差異明顯(P<0.0
14、1)。對照藥物地塞米松組與模型組相比則能明顯降低COPD小鼠血漿和BALF中TNF-α和IL-17的含量(P<0.01)。提示益氣化痰方可以降低氣道炎癥反應(yīng),其機制可能與Th17/IL-17介導(dǎo)COPD的慢性炎癥及免疫保護應(yīng)答相關(guān)。
2.3 COPD小鼠BALF中Muc5ac含量的變化 ELISA結(jié)果顯示,正常組小鼠BALF中Muc5ac的含量OD值低于模型組,提示實驗動物模型在炎癥因子作用下上調(diào)Muc5ac的表達。益氣化痰方
15、高、中、低劑量BALF中Muc5ac含量逐漸降低,但低劑量組BALF中Muc5ac含量與COPD模型組無明顯統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05),中、高劑量組和地塞米松組BALF中Muc5ac含量與COPD模型組有統(tǒng)計學(xué)意義差異(P<0.05),提示益氣化痰方通過抑制小鼠肺組織Muc5ac分泌,改善COPD氣道重構(gòu)。
2.4 COPD小鼠肺組織Muc5ac和AQP5 mRNA水平的變化RT-PCR結(jié)果顯示,同正常小鼠相比,模型組小鼠Mu
16、c5ac mRNA水平顯著升高(P<0.01),而AQP5 mRNA轉(zhuǎn)錄水平則顯著下調(diào)(P<0.01)。提示實驗小鼠肺組織Muc5ac mRNA表達亢進,AQP5 mRNA表達抑制,兩者呈負相關(guān);益氣化痰方高、中、低劑量均能明顯下調(diào)模型小鼠肺組織Muc5ac mRNA水平,上調(diào)AQP5 mRNA水平,其中高、中劑量組Muc5ac和AQP5 mRNA表達水平與模型組有顯著差異(P<0.01),低劑量組下調(diào)Muc5acmRNA表達水平與模型
17、組有明顯差異(P<0.05)。提示高劑量組益氣化痰方對COPD小鼠肺組織Muc5ac、AQP5 mRNA轉(zhuǎn)錄水平優(yōu)于低劑量組,且各劑量組對Muc5ac和AQP5 mRNA的表達呈量效依賴關(guān)系。
2.5 COPD小鼠肺組織Muc5ac和AQP5 mRNA蛋白水平的變化Western blot結(jié)果顯示,與正常組比較,COPD模型組小鼠Muc5ac mRNA水平顯著升高(P<0.01),而AQP5 mRNA水平則顯著降低(P<0.0
18、1)。表明益氣化痰方可升高COPD小鼠肺組織Muc5ac mRNA蛋白水平,抑制AQP5 mRNA蛋白水平;益氣化痰方高、中、低劑量COPD小鼠肺組織中Muc5ac mRNA蛋白條帶印記顏色均變淺,表達強度顯著減弱(P<0.01),AQP5 mRNA條帶印記顏色均加深,表達強度顯著增強(P<0.01或P<0.05),其中高、中、低劑量組Muc5ac和AQP5 mRNA表達水平與模型組有顯著差異(P<0.01),實驗顯示高劑量益氣化痰方和
19、地塞米松組上調(diào)COPD小鼠肺組織Muc5ac mRNA蛋白水平,下調(diào)AQP5 mRNA水平的效能優(yōu)于低劑量組,且各劑量組對Muc5ac和AQP5 mRNA蛋白的表達水平呈量效依賴關(guān)系。
3.益氣化痰方對COPD小鼠肺組織MAPK和NF-κ B信號通路的影響
3.1 COPD小鼠肺組織MAPK通路的變化Western blot結(jié)果顯示,與COPD正常組比較,模型組小鼠肺組織內(nèi)Erk、P38和JNK蛋白水平顯和磷酸化的蛋
20、白分子的比例顯著增高,而正常組小鼠肺組織蛋白含量和磷酸化處于較低水平;提示在COPD模型組小鼠肺組織內(nèi),MAPK信號通路可被明顯激活;益氣化痰方高、中、低組均能抑制COPD小鼠肺內(nèi)MAPK信號通路的活化,其中高劑量的中藥抑制作用最強,中劑量組次之,低劑量組的作用較弱。陽性對照藥物-地塞米松則明顯抑制COPD小鼠肺內(nèi)MAPK信號通路的活化。
3.2 COPD小鼠肺組織NF-κ B信號通路的變化Western blot結(jié)果顯示:與
21、正常組比較COPD小鼠肺組織胞漿內(nèi)IkappaB含量很高,NF-κ B信號通路處于活化狀態(tài),提示COPD模型組小鼠肺組織內(nèi),NF-kappa B在下游信號通路發(fā)揮調(diào)控作用;益氣化痰方高、中、低劑量組均能明顯抑制COPD小鼠肺內(nèi)NF-kappa B信號通路的活化。
研究結(jié)論:
1.COPD模型小鼠肺組織存在CD4+T/Th17細胞介導(dǎo)的IL-17細胞因子高表達,并通過其效應(yīng)因子IL-17刺激TNF-α及其他炎癥因子,增
22、強Muc5ac表達水平,促使氣道粘液分泌增多,并發(fā)生氣道阻塞及重塑。
2.益氣化痰方能夠降低COPD小鼠肺組織、血漿和BALF的IL-17、TNF-α等炎癥細胞含量,減低Muc5ac含量,改善模型小鼠肺組織病理損害;益氣化痰中藥能明顯地升高COPD小鼠的單核巨噬細胞百分比,降低淋巴細胞、中性粒細胞的百分比,對COPD小鼠炎癥細胞分泌具有抑制作用。
3.益氣化痰方可以降低COPD小鼠肺通氣功能PIF、PEF和MV數(shù)值,
23、明顯改善COPD小鼠氣道的高反應(yīng)狀態(tài)。但各項指標(biāo)數(shù)據(jù)不高于正常對照組。
4.益氣化痰方可以上調(diào)COPD小鼠肺組織Muc5ac mRNA蛋白轉(zhuǎn)錄水平,下調(diào)AQP5 mRNA轉(zhuǎn)錄水平,改善氣道黏液高分泌狀態(tài)。
5.益氣化痰方通過抑制COPD小鼠肺內(nèi)MAPK和NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的活化,發(fā)揮對COPD小鼠氣道炎癥因子、粘液高分泌的調(diào)節(jié)作用,這兩個通路在調(diào)節(jié)IL-17受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中起著關(guān)鍵作用。因此,從免疫保護及炎癥互相作
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