益氣化痰方對(duì)慢性阻塞性肺疾病小鼠氣道炎癥及黏液分泌的調(diào)節(jié)機(jī)制研究.pdf

1、研究目的:
　　通過建立COPD小鼠模型，檢測(cè)益氣化痰方對(duì)不同組別小鼠血漿、BALF和肺組織中TNF-α、IL-17、Muc5ac的表達(dá)水平，探討益氣化痰方對(duì)小鼠肺組織MAPK和NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路活化的影響及Muc5ac和AQP5 mRNA的基因表達(dá)影響，研究益氣化痰方對(duì)氣道炎癥、黏液分泌調(diào)節(jié)作用的機(jī)制。從分子生物學(xué)層面闡釋中醫(yī)學(xué)理論“肺主氣-益氣”，“肺主通調(diào)水道-化痰”以及益氣、化痰治則的內(nèi)在關(guān)系，從而為COPD中醫(yī)治療提

2、供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和參考。
　　研究方法:
　　1.選用健康雄性C57BL小鼠60只，隨機(jī)數(shù)字法分成6組:分別是正常對(duì)照組，COPD模型組，低劑量中藥組，中劑量中藥組，高劑量中藥組，地塞米松組。每組10只。采用香煙煙熏方法建立慢性阻塞性肺疾病小鼠模型，從小鼠一般情況、肺組織病理形態(tài)學(xué)（肺組織肉眼觀察、HE染色病理切片）觀察以及BALF細(xì)胞組成及細(xì)胞總數(shù)三個(gè)指標(biāo)評(píng)價(jià)慢性阻塞性肺病小鼠模型以及益氣化痰方對(duì)慢性阻塞性肺病小鼠炎癥細(xì)胞水平和

3、病理改變的影響;
　　2.采用WBP全身體積記錄儀在造模的第20周對(duì)各組小鼠進(jìn)行無創(chuàng)肺功能檢查，記錄PIF、PEF和MV。了解動(dòng)物模型的氣道阻力和肺順應(yīng)性情況，探討實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的可靠性。
　　3.采用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)模型小鼠肺組織內(nèi)TNF-α、IL-17、Muc5ac的表達(dá)。比較分析益氣化痰方對(duì)肺組織內(nèi)細(xì)胞因子的表達(dá)的影響，研究益氣化痰中藥對(duì)COPD小鼠的治療作用。
　　4.應(yīng)用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELI

4、SA)檢測(cè)模型小鼠血漿和BALF中TNF-α、IL-17含量和BALF中Muc5ac含量。探討益氣化痰方對(duì)模型小鼠抗炎、抑制黏蛋白分泌的作用機(jī)制。
　　5.應(yīng)用RT-PCR方法檢測(cè)模型小鼠肺組織Muc5ac和AQP5 mRNA的基因表達(dá)情況。分析益氣化痰方對(duì)其表達(dá)水平的影響，從炎癥/免疫反應(yīng)介質(zhì)角度評(píng)價(jià)不同劑量組的藥效及其作用靶點(diǎn)。
　　6.采用Western blot方法檢測(cè)肺組織p38-MARK、Erk、JNK和NF-κ

5、B磷酸化的蛋白含量。分析益氣化痰方對(duì)COPD小鼠肺組織MAPK和NF-κB信號(hào)通路的影響，進(jìn)一步證明益氣化痰方是通過IL-17/MAPK、NF-κB信號(hào)通路調(diào)控氣道炎癥反應(yīng)，改變氣道上皮Muc5ac mRNA和AQP5表達(dá)。
　　7.實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用(x)±s表示，采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。不同組間采用one-way ANOVA進(jìn)行方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，以P＜0.01為顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　

6、　研究結(jié)果:
　　1.益氣化痰方對(duì)COPD小鼠各指標(biāo)的影響
　　1.1組織形態(tài)學(xué)觀察HE染色后鏡下觀察，結(jié)果顯示:正常對(duì)照組小鼠的肺組織內(nèi)，支氣管粘膜上皮及肺泡結(jié)構(gòu)完整，支氣管管腔內(nèi)纖毛排列整齊，未見有明顯的分泌物，管壁未見增厚，粘膜下層未見有明顯的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡腔未見有明顯的擴(kuò)張。模型組小鼠的肺組織內(nèi)，支氣管上皮細(xì)胞排列紊亂，柱狀上皮細(xì)胞脫落嚴(yán)重，杯狀細(xì)胞數(shù)量增多，纖毛少量倒伏脫落，不整齊排列，支氣管管壁增厚，管腔變形

7、狹窄，粘膜下腺體明顯增生，伴有大量的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，以中性粒細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞為主。肺泡壁變薄或斷裂，肺泡腔增大，部分融合成肺大皰，導(dǎo)致肺泡的數(shù)量明顯減少，肺間質(zhì)和肺泡腔內(nèi)可見大量的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。
　　1.2肺組織切片觀察PAS染色可以將肺組織中粘液染成紫紅色。正常對(duì)照組小鼠肺內(nèi)支氣管內(nèi)粘液較少，PAS染色陽性細(xì)胞的比例也比較低，而模型組小鼠肺組織內(nèi)支氣管內(nèi)粘液明顯增多，PAS染色細(xì)胞的數(shù)量也明顯增多。
　　1.3肺

8、功能指標(biāo)改變采用WBP全身體積記錄儀在造模的第20周對(duì)各組小鼠進(jìn)行無創(chuàng)的肺功能檢查。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與正常對(duì)照組小鼠相比，模型組小鼠PIF、PEF和MV數(shù)值顯著下降(P＜0.01)，符合COPD的臨床肺功能特點(diǎn)。高、中、低劑量的益氣化痰方均能明顯改善COPD小鼠氣道的高反應(yīng)狀態(tài)(P＜0.05)，改善作用同劑量呈現(xiàn)一定的依賴關(guān)系，高劑量的益氣化痰方改善作用最強(qiáng)，但各項(xiàng)指標(biāo)數(shù)據(jù)仍低于正常對(duì)照組小鼠，中劑量的益氣化痰方的改善作用次之，低劑量益氣化痰

9、方的改善作用較弱，而地塞米松組氣道阻力沒有明顯的改善作用(P＞0.05)。
　　1.4 BALF細(xì)胞組成及細(xì)胞總數(shù)的變化研究顯示COPD模型組的總白細(xì)胞計(jì)數(shù)值最高，與正常組相比有顯著性差異(P＞0.05)，益氣化痰中藥高、中、低劑量組與模型組比較有顯著性差異(P＜0.05或P＜0.01)，說明益氣化痰中藥對(duì)COPD大鼠炎癥細(xì)胞有明顯的抑制效果;在細(xì)胞分類計(jì)數(shù)中，各組均以單核巨噬細(xì)胞為主，與正常對(duì)照組比較，模型組單核巨噬細(xì)胞百分比顯

10、著降低(P＜0.01），而淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞百分比均顯著增加(P＜0.01)，與模型組比較，益氣化痰中藥高、中、低劑量組單核巨噬細(xì)胞顯著增加（P＜0.01或P＜0.05），淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、百分比顯著降低(P＜0.01或P＜0.05)，提示香煙煙霧造模能誘導(dǎo)小鼠單核巨噬細(xì)胞百分比降低、淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞百分比升高，而益氣化痰方能明顯地升高COPD小鼠的單核巨噬細(xì)胞百分比，降低淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞的百分比，對(duì)COPD小鼠炎癥細(xì)胞的

11、抑制分泌作用明顯;不同劑量益氣化痰中藥對(duì)實(shí)驗(yàn)小鼠炎癥細(xì)胞的影響具有明顯的量效關(guān)系。高、中、低劑量益氣化痰方對(duì)IL-17介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)有抑制作用，其中地塞米松組BALF中的炎癥細(xì)胞數(shù)量明顯減少，高劑量中藥組次之，緊接著是中劑量組，低劑量組小鼠BALF中的炎癥細(xì)胞數(shù)量減少最不明顯。
　　2.益氣化痰方對(duì)實(shí)驗(yàn)小鼠TNF-α、IL-17、Muc5ac表達(dá)的影響
　　2.1 COPD小鼠肺組織內(nèi)TNF-α、IL-17、Muc5ac的表

12、達(dá)的變化免疫組化檢測(cè)結(jié)果顯示，IL-17、TNF-α、Muc5ac在正常小鼠肺組織呈弱陽性表達(dá)。而在COPD模型組小鼠肺組織內(nèi)，IL-17、TNF-α、Muc5ac呈強(qiáng)陽性表達(dá)。提示IL-17可協(xié)同活化的巨噬細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α，促進(jìn)TNF-α誘導(dǎo)的多種中性粒細(xì)胞趨化，放大炎癥反應(yīng)，使粘液分泌增加。激素可以阻斷或者抑制這種炎癥趨化因子表達(dá)，實(shí)驗(yàn)也證明地塞米松也能明顯降低COPD小鼠肺組織內(nèi)TNF-α和IL-17的表達(dá)。
　　2.2

13、COPD小鼠血漿和BALF中TNF-α、IL-17含量的變化ELISA結(jié)果顯示，正常小鼠血漿和BALF與COPD模型組中血漿和BALF相比TNF-α的含量有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01);正常小鼠血漿和BALF與COPD模型通過IL-17募集中性粒細(xì)胞分泌炎性介質(zhì)，誘導(dǎo)產(chǎn)生的各種趨化因子，使炎癥細(xì)胞到達(dá)靶部位。與COPD小鼠模型組比較，益氣化痰中藥高、中、低劑量組血漿和BALF中TNF-α和IL-17的含量逐漸降低，差異明顯(P＜0.0

14、1)。對(duì)照藥物地塞米松組與模型組相比則能明顯降低COPD小鼠血漿和BALF中TNF-α和IL-17的含量(P＜0.01)。提示益氣化痰方可以降低氣道炎癥反應(yīng)，其機(jī)制可能與Th17/IL-17介導(dǎo)COPD的慢性炎癥及免疫保護(hù)應(yīng)答相關(guān)。
　　2.3 COPD小鼠BALF中Muc5ac含量的變化 ELISA結(jié)果顯示，正常組小鼠BALF中Muc5ac的含量OD值低于模型組，提示實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型在炎癥因子作用下上調(diào)Muc5ac的表達(dá)。益氣化痰方

15、高、中、低劑量BALF中Muc5ac含量逐漸降低，但低劑量組BALF中Muc5ac含量與COPD模型組無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)，中、高劑量組和地塞米松組BALF中Muc5ac含量與COPD模型組有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義差異(P＜0.05)，提示益氣化痰方通過抑制小鼠肺組織Muc5ac分泌，改善COPD氣道重構(gòu)。
　　2.4 COPD小鼠肺組織Muc5ac和AQP5 mRNA水平的變化RT-PCR結(jié)果顯示，同正常小鼠相比，模型組小鼠Mu

16、c5ac mRNA水平顯著升高(P＜0.01)，而AQP5 mRNA轉(zhuǎn)錄水平則顯著下調(diào)（P＜0.01）。提示實(shí)驗(yàn)小鼠肺組織Muc5ac mRNA表達(dá)亢進(jìn)，AQP5 mRNA表達(dá)抑制，兩者呈負(fù)相關(guān);益氣化痰方高、中、低劑量均能明顯下調(diào)模型小鼠肺組織Muc5ac mRNA水平，上調(diào)AQP5 mRNA水平，其中高、中劑量組Muc5ac和AQP5 mRNA表達(dá)水平與模型組有顯著差異(P＜0.01)，低劑量組下調(diào)Muc5acmRNA表達(dá)水平與模型

17、組有明顯差異(P＜0.05)。提示高劑量組益氣化痰方對(duì)COPD小鼠肺組織Muc5ac、AQP5 mRNA轉(zhuǎn)錄水平優(yōu)于低劑量組，且各劑量組對(duì)Muc5ac和AQP5 mRNA的表達(dá)呈量效依賴關(guān)系。
　　2.5 COPD小鼠肺組織Muc5ac和AQP5 mRNA蛋白水平的變化Western blot結(jié)果顯示，與正常組比較，COPD模型組小鼠Muc5ac mRNA水平顯著升高(P＜0.01)，而AQP5 mRNA水平則顯著降低（P＜0.0

18、1）。表明益氣化痰方可升高COPD小鼠肺組織Muc5ac mRNA蛋白水平，抑制AQP5 mRNA蛋白水平;益氣化痰方高、中、低劑量COPD小鼠肺組織中Muc5ac mRNA蛋白條帶印記顏色均變淺，表達(dá)強(qiáng)度顯著減弱（P＜0.01），AQP5 mRNA條帶印記顏色均加深，表達(dá)強(qiáng)度顯著增強(qiáng)(P＜0.01或P＜0.05)，其中高、中、低劑量組Muc5ac和AQP5 mRNA表達(dá)水平與模型組有顯著差異(P＜0.01)，實(shí)驗(yàn)顯示高劑量益氣化痰方和

19、地塞米松組上調(diào)COPD小鼠肺組織Muc5ac mRNA蛋白水平，下調(diào)AQP5 mRNA水平的效能優(yōu)于低劑量組，且各劑量組對(duì)Muc5ac和AQP5 mRNA蛋白的表達(dá)水平呈量效依賴關(guān)系。
　　3.益氣化痰方對(duì)COPD小鼠肺組織MAPK和NF-κ B信號(hào)通路的影響
　　3.1 COPD小鼠肺組織MAPK通路的變化Western blot結(jié)果顯示，與COPD正常組比較，模型組小鼠肺組織內(nèi)Erk、P38和JNK蛋白水平顯和磷酸化的蛋

20、白分子的比例顯著增高，而正常組小鼠肺組織蛋白含量和磷酸化處于較低水平;提示在COPD模型組小鼠肺組織內(nèi)，MAPK信號(hào)通路可被明顯激活;益氣化痰方高、中、低組均能抑制COPD小鼠肺內(nèi)MAPK信號(hào)通路的活化，其中高劑量的中藥抑制作用最強(qiáng)，中劑量組次之，低劑量組的作用較弱。陽性對(duì)照藥物-地塞米松則明顯抑制COPD小鼠肺內(nèi)MAPK信號(hào)通路的活化。
　　3.2 COPD小鼠肺組織NF-κ B信號(hào)通路的變化Western blot結(jié)果顯示:與

21、正常組比較COPD小鼠肺組織胞漿內(nèi)IkappaB含量很高，NF-κ B信號(hào)通路處于活化狀態(tài)，提示COPD模型組小鼠肺組織內(nèi)，NF-kappa B在下游信號(hào)通路發(fā)揮調(diào)控作用;益氣化痰方高、中、低劑量組均能明顯抑制COPD小鼠肺內(nèi)NF-kappa B信號(hào)通路的活化。
　　研究結(jié)論:
　　1.COPD模型小鼠肺組織存在CD4+T/Th17細(xì)胞介導(dǎo)的IL-17細(xì)胞因子高表達(dá)，并通過其效應(yīng)因子IL-17刺激TNF-α及其他炎癥因子，增

22、強(qiáng)Muc5ac表達(dá)水平，促使氣道粘液分泌增多，并發(fā)生氣道阻塞及重塑。
　　2.益氣化痰方能夠降低COPD小鼠肺組織、血漿和BALF的IL-17、TNF-α等炎癥細(xì)胞含量，減低Muc5ac含量，改善模型小鼠肺組織病理損害;益氣化痰中藥能明顯地升高COPD小鼠的單核巨噬細(xì)胞百分比，降低淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞的百分比，對(duì)COPD小鼠炎癥細(xì)胞分泌具有抑制作用。
　　3.益氣化痰方可以降低COPD小鼠肺通氣功能PIF、PEF和MV數(shù)值，

23、明顯改善COPD小鼠氣道的高反應(yīng)狀態(tài)。但各項(xiàng)指標(biāo)數(shù)據(jù)不高于正常對(duì)照組。
　　4.益氣化痰方可以上調(diào)COPD小鼠肺組織Muc5ac mRNA蛋白轉(zhuǎn)錄水平，下調(diào)AQP5 mRNA轉(zhuǎn)錄水平，改善氣道黏液高分泌狀態(tài)。
　　5.益氣化痰方通過抑制COPD小鼠肺內(nèi)MAPK和NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的活化，發(fā)揮對(duì)COPD小鼠氣道炎癥因子、粘液高分泌的調(diào)節(jié)作用，這兩個(gè)通路在調(diào)節(jié)IL-17受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起著關(guān)鍵作用。因此，從免疫保護(hù)及炎癥互相作