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文檔簡介
1、研究背景及意義: 支氣管哮喘(簡稱哮喘)是一種嚴重危害人類健康的慢性呼吸道疾病,以氣道非特異性炎癥、氣道反應性增高及氣道重建為主要特征。哮喘的發(fā)生與發(fā)展受多種基因的調控,從而決定淋巴細胞亞型,免疫反應性,嗜酸粒細胞(Eosinophils,EOS)及肥大細胞的遷移、活化、細胞因子合成、粘附分子表達及組織修復過程。盡管哮喘基礎研究取得較大的進步,哮喘的治療更多的還是依賴于糖皮質激素、β2腎上腺素受體激動劑等幾類藥物。評估哮喘的指標
2、仍以肺功能指標、呼出氣-氧化氮及誘導痰EOS為主,因此哮喘臨床診治策略仍有待進一步完善。 EOS與哮喘氣道炎癥、免疫調控、上皮細胞損傷、上皮下基質沉積、氣道阻塞及肺功能下降等密切相關。臨床研究也顯示誘導痰EOS可作為哮喘臨床控制的有效指標。2006年全球哮喘防治創(chuàng)議(Global Initiative for Asthma,GINA)明確指出:EOS可能在哮喘氣道重建過程中發(fā)揮重要作用,而氣道重建很可能是未來哮喘治療的新靶點。
3、 足夠證據(jù)表明EOS活化在哮喘發(fā)生發(fā)展中起重要作用,但其活化具體機制尚未完全闡明。近年來也有多項研究觀察到了EOS某些基因發(fā)生改變,但其更多的還是體外或者是觀察單一通路在EOS調控的機制?;谶@些問題及哮喘疾病的復雜性,選擇體外或者單因素分析顯得非常局限,而選擇哮喘病人在不同病情狀態(tài)進行基因表達譜分析有利于發(fā)現(xiàn)真正參與疾病發(fā)生發(fā)展相關的候選基因。因此本研究首先以哮喘患者不同時期EOS為主要對象進行基因表達譜的分析。在獲得多種EOS
4、差異表達基因后,因為氧化應激和EOS遷移是哮喘的重要特征。因此我們分別選擇與哮喘氧化應激、細胞骨架重建相關基因硫氧還蛋白結合蛋白2/維生素D3上調蛋白1(Thioredoxin-binding Protein 2/Vitamin D3 Up-regulated Protein1,VDUPI)、細胞骨架蛋白相關基因肌動蛋白解聚因子/絲切肌動蛋白slingshot磷酸酶2(SsH2L)進行進一步驗證及功能分析,為未來針對炎性靶細胞治療提供一
5、定的理論依據(jù)。 方法: 1.哮喘患者外周血EOS cDNA消減文庫構建及鑒定 在1例明確診斷為哮喘患者急性發(fā)作時及緩解時分別提取外周血EOS總RNA,應用Super SMART cDNA synthesis和SSH技術,構建哮喘時EOS相關基因消減cDNA文庫,測序、通過差異篩選(Differential Screening,DS)對部分陽性克隆進行篩選驗證,并進行同源性對比分析。 2.哮喘患者VDUPl
6、和SSH-2L差異表達分析 共選取正常對照10例和哮喘患者發(fā)作期15例和緩解期15例,提取患者外周血EOS總RNA,應用半定量RT-PCR和Western Blotting技術驗證VDUP1和SSH-2L差異表達。 3.VDUPl與EOS活化關系及其在哮喘中的作用 研究對象來自于第二部分。留取患者誘導痰,測量誘導痰EOS%,用酶聯(lián)免疫吸附實驗(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay,E
7、LISA)檢測患者血清嗜酸粒細胞陽離子蛋白(Eosinophil Cationic Protein,ECP)濃度。分析VDUP1表達與哮喘患者誘導痰EOS%、肺功能指標一秒鐘用力呼氣容積占預計值百分比(Forced Expiratory Volume in One Second to Predicted Value,F(xiàn)EVI%)、最大呼氣流速占預計值百分LL(Peak Expiratory Flow to Predicted Value
8、,PEF%)及血清ECP濃度關系。 4.硫氧還蛋白(Thioredoxin,TRX)氧化劑和TRX硫醇基烷化劑對EOS的VDUP1作用環(huán)節(jié)的影響 以IL-5(EOS向肺部浸潤、活化必需的細胞因子)刺激孵育正常EOS,同時用ELISA法檢測血清和培養(yǎng)上清液ECP濃度。研究VDUP1表達對EOS功能影響;因VDUPl功能發(fā)揮主要依賴于與TRX氧化還原中心相互作用而完成,因此在孵育的細胞中,兩組分別給予破壞TRX氧化還原中心的
9、TRX氧化劑二酰胺和烷化劑2,4二氯二硝基苯,阻斷VDUP1與TRX相互作用,通過觀察VDUP1表達變化與上清液中ECP含量,初步探討VDUP1與TRX相互作用及其參與EOS活化的可能機制。統(tǒng)計學分析采用SPSS 10.0軟件的One WayANOVA和Bivariate orrelations方法,組間比較采用LSD方法檢驗。 結果: 1、成功構建上調、下調兩個哮喘相關基因cDNA消減文庫,經進一步差異篩選,同源性對比
10、分析,篩選出與細胞骨架重建相關基因6個,包括SSH-2L,蛋白磷酸酶1催化亞單位B亞型,蛋白酪氨酸磷酸酶非受體型6,蛋白酪氨酸磷酸酶非受體12,DOCk8,肌球蛋白輕鏈結合蛋白。與氧化應激及信號轉導有關基因8個,包括VDUPl、高移動性蛋白2、水通道蛋白9、雙重特異磷酸酶1、跨膜蛋白BRI、糖皮質激素受體結合蛋白1、SNF-1相關激酶、DICEl等。 2、外周血EOS SSH2L相對表達量在哮喘發(fā)作組、緩解組及正常組分別為(1.
11、648±0.68)、(0.918±0.395)和(0.876±0.436),其中發(fā)作組顯著高于正常組(n=5,P=0.038)與緩解組(n=5,P=0.047),而緩解組基因表達與正常對照組無顯著差異(P=0.901);VDUPlmRNA相對表達量在發(fā)作組、正常組及緩解組分別為(0.228±0.117),(0.674±0.171),(0.699±0.138),發(fā)作組表達比正常組與治療組明顯降低(P=0.001),而相應蛋白相對水平分別為
12、(0.348 ± 0.147),(0.402±0.121),(0.422±0.163),發(fā)作組蛋白水平也均顯著低于正常組及緩解組(P=0.001)。正常組與緩解組在mRNA水平(P=0.655)和蛋白水平(P=0.623)均無顯著差異。 3、血清ECP濃度在哮喘發(fā)作組、哮喘緩解組及正常對照分別為(4.41±1.36)ng/ml,(14.3±4.29)ng/ml,(6.70±1.40)ng/ml,誘導痰EOS%在三組分別為(1.3
13、5%±0.35%)、(11%±4.8%)、(3.6%±0.89%)。統(tǒng)計相關性分析表明,VDUP1表達與誘導痰EOS%(r=0.714,p=0.000)及血清ECP濃度(R=0.735,P=0.000)呈顯著負相關,而緩解組基因表達與對照組無顯著差異。 4、IL-5刺激下,EOS VDUP1表達顯著降低(P=0.000),同時伴上清ECP顯著升高(P=0.000)。而應用破壞VDUP1作用環(huán)節(jié)的TRX氧化劑二酰胺和烷化劑2,4二
14、氯二硝基苯并不影響IL-5對VDUP1表達的影響,但可使培養(yǎng)液上清的ECP濃度下降。 結論: 1、成功構建上調、下調兩個哮喘相關基因cDNA消減文庫,經篩選共獲得6個與細胞骨架重建的相關基因和8個與氧化應激及信號轉導相關基因,哮喘患者不同狀態(tài)的EOS基因表達可能不同; 2、SSH-2L基因在哮喘發(fā)作組外周血EOS顯著高表達,表明SSH-2L可能在調控EOS遷移、趨化方面發(fā)揮重要作用; 3、VDUPl表達可
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