菲立磁標(biāo)記恒河猴骨髓源性神經(jīng)干細(xì)胞自體移植磁共振在體研究.pdf

1、研究背景 干細(xì)胞是指有多種分化潛能和自我更新能力的細(xì)胞，這種多潛能細(xì)胞存在于成年個體的許多組織和胚胎中。許多研究已經(jīng)證明哺乳動物腦內(nèi)的干細(xì)胞或祖細(xì)胞在生理或病理狀態(tài)下都具有很強的遷移和分化能力，實行干細(xì)胞替代治療能夠有效地重建缺損的組織功能，是一種很有前途的臨床治療策略。 基于以上原因，如果能夠在合適的示蹤劑幫助下，采用無創(chuàng)傷性影像學(xué)技術(shù)來在體識別、跟蹤移植后骨髓基質(zhì)細(xì)胞的存活狀態(tài)及與宿主神經(jīng)組織整合情況并科學(xué)評價療效，

2、將大大提高骨髓基質(zhì)細(xì)胞移植療法的學(xué)術(shù)價值。最新研究顯示核磁共振造影劑—葡聚糖修飾的超順磁性氧化鐵納米顆粒已經(jīng)成功在體外用于多種細(xì)胞的標(biāo)記，從而為我們提供了利用核磁共振活體動態(tài)監(jiān)測干細(xì)胞在腦內(nèi)遷移的可能。 第一章恒河猴骨髓基質(zhì)細(xì)胞體外分離培養(yǎng)和誘導(dǎo)分化的實驗研究 目的：探索神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基和細(xì)胞因子對恒河猴骨髓基質(zhì)細(xì)胞體外分離、增殖和誘導(dǎo)分化的影響。 方法：無菌條件下行髂骨穿刺取骨髓，梯度密度離心法分離獲取大鼠骨髓

3、基質(zhì)細(xì)胞。原代培養(yǎng)第3天后，實驗組利用神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基和堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)、白血病抑制因子(LIF)，進行體外培養(yǎng)、誘導(dǎo)、增殖。對照組用神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基進行培養(yǎng)增殖。同時觀察胎牛血清和維甲酸(RA)對細(xì)胞的誘導(dǎo)作用。利用倒置相差光學(xué)顯微鏡追蹤觀察細(xì)胞生長情況并計數(shù)和拍照。利用抗神經(jīng)巢蛋白、神經(jīng)元特異性烯醇化酶、膠質(zhì)原性纖維酸性蛋白免疫細(xì)胞化學(xué)方法對骨髓基質(zhì)細(xì)胞分化后的神經(jīng)干細(xì)胞、神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞分別進行特異性鑒定。

4、 結(jié)果：倒置相差顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，初接種的細(xì)胞為懸浮狀態(tài)，呈圓形，細(xì)胞邊緣完整、光滑。接種后的10h內(nèi)，骨髓基質(zhì)細(xì)胞開始貼壁，72h后貼壁細(xì)胞不再增多。更換培養(yǎng)基后，可見較純的貼壁細(xì)胞，72h換液去除非粘附細(xì)胞后，可見剩余的粘附細(xì)胞有三種形態(tài)：大而扁平的成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞、中等大小的圓形細(xì)胞/卵圓形細(xì)胞和小的圓形細(xì)胞。對照組細(xì)胞在原代培養(yǎng)第6天時有少許細(xì)胞克隆團形成，培養(yǎng)第10天時細(xì)胞數(shù)量明顯開始增多，可見到島嶼狀細(xì)胞克隆團的形成。

5、 加入bFGF+LIF的實驗組細(xì)胞，24h后可見中等大小的圓形細(xì)胞有顯著的細(xì)胞分裂相。培養(yǎng)第6天時可見到許多細(xì)胞克隆團形成，培養(yǎng)8d細(xì)胞數(shù)量開始顯著增多，可見到島嶼狀細(xì)胞克隆團的形成。至第12天時，可見大量克隆團形成，細(xì)胞幾乎爬滿培養(yǎng)板底部。LIF組或bFGF組細(xì)胞生長情況與bFGF+LIF組細(xì)胞類似，增殖細(xì)胞總數(shù)不如前者，但與對照組相比細(xì)胞數(shù)量顯著增多(F=4737.953，P＜0.001)。 原代培養(yǎng)第5天時實驗組和對

6、照組多數(shù)細(xì)胞陽性表達(dá)神經(jīng)干細(xì)胞特異性抗原—神經(jīng)巢蛋白(Nestin)抗原，證實已經(jīng)形成骨髓基質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)干細(xì)胞(BMSCs-D-NSCs)。胎牛血清和RA誘導(dǎo)后，BMSCs-D-NSCs能分化出神經(jīng)元樣細(xì)胞和膠質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞，免疫細(xì)胞化學(xué)檢測可見有神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)、膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)的表達(dá)。 結(jié)論：實驗結(jié)果表明，恒河猴骨髓基質(zhì)細(xì)胞是多分化潛能的細(xì)胞，具有較強的自我更新能力和多分化能力。在合適的培養(yǎng)條件下，

7、骨髓基質(zhì)細(xì)胞可以快速擴增，并可以向神經(jīng)干細(xì)胞、神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞等方向分化。因此，恒河猴骨髓基質(zhì)細(xì)胞可以考慮作為修復(fù)中樞神經(jīng)系統(tǒng)損害細(xì)胞移植治療的種子細(xì)胞之一。 第二章菲立磁標(biāo)記恒河猴骨髓基質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞生物學(xué)研究 目的：利用在體神經(jīng)影像學(xué)追蹤干細(xì)胞在腦內(nèi)的移植無疑能夠幫助我們正確評價移植細(xì)胞對功能恢復(fù)的調(diào)節(jié)情況。菲立磁(Feridex)是一種超順磁性氧化鐵，可以作為磁共振成像(MRI)的對比造影劑，臨床上已經(jīng)被用于肝臟

8、成像。本研究旨在初步探索利用菲立磁和轉(zhuǎn)染試劑多聚賴氨酸體外磁性標(biāo)記恒河猴骨髓基質(zhì)細(xì)胞的可行性，為臨床上應(yīng)用磁共振成像追蹤標(biāo)記細(xì)胞奠定基礎(chǔ)。 方法：無菌條件下取恒河猴骨髓，梯度密度離心法分離獲取恒河猴骨髓基質(zhì)細(xì)胞，使用“菲立磁-多聚賴氨酸復(fù)合物”標(biāo)記骨髓基質(zhì)細(xì)胞。采用普魯士蘭染色和透射電鏡對細(xì)胞內(nèi)鐵和標(biāo)記效率進行檢測，利用倒置顯微鏡和掃描電鏡觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化，菲立磁標(biāo)記骨髓基質(zhì)細(xì)胞與神經(jīng)元聯(lián)合培養(yǎng)檢測菲立磁的細(xì)胞滲漏性，采用四唑

9、鹽(MTT)實驗鑒定菲立磁標(biāo)記骨髓基質(zhì)細(xì)胞的活力。應(yīng)用流式細(xì)胞儀、熒光染色和透射電鏡分別對細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡情況進行分析，采用免疫細(xì)胞化學(xué)方法和TRAP-ELISA法分別對標(biāo)記后骨髓基質(zhì)細(xì)胞的分化、增殖能力和端粒酶表達(dá)進行測定評估。 結(jié)果：細(xì)胞內(nèi)鐵的鑒定：普魯士藍(lán)染色顯示菲立磁-多聚賴氨酸(FE-PLL)復(fù)合物標(biāo)記骨髓基質(zhì)細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)細(xì)小的藍(lán)色鐵顆粒。電鏡結(jié)果顯示FE-PLL復(fù)合物標(biāo)記的骨髓基質(zhì)細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)含有許多包裹鐵顆粒的囊

10、泡。 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察：倒置相差顯微鏡下不同培養(yǎng)階段標(biāo)記組和未標(biāo)記組BMSCs相比較，兩者之間細(xì)胞形態(tài)無明顯差異。掃描電鏡下可見不同培養(yǎng)階段標(biāo)記組和未標(biāo)記組BMSCs相比較，兩者之間細(xì)胞形狀和大小無明顯差異，未標(biāo)記組BMSCs表面相對光滑，而標(biāo)記組細(xì)胞表面可見細(xì)小的鐵顆粒附著。 滲漏性檢測：FE-PLL復(fù)合物標(biāo)記干細(xì)胞與大腦皮層神經(jīng)元共培養(yǎng)后，Prussianblue染色顯示標(biāo)記干細(xì)胞為陽性，未標(biāo)記大腦皮層神經(jīng)元內(nèi)呈陰性，

11、說明FE-PLL復(fù)合物標(biāo)記后細(xì)胞內(nèi)Fe不會滲漏到細(xì)胞外被其它細(xì)胞攝取。 FE-PLL復(fù)合物對細(xì)胞活力的影響：MTT結(jié)果顯示，標(biāo)記細(xì)胞與未標(biāo)記細(xì)胞相比，吸光度值無顯著性差異(F=0.579，P=0.457)，說明FE-PLL復(fù)合物對細(xì)胞活力沒有明顯的影響。 FE-PLL復(fù)合物對細(xì)胞周期的影響：流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示，F(xiàn)E-PLL標(biāo)記組細(xì)胞G1/G0、S、G2/M期的細(xì)胞所占百分比和正常未標(biāo)記組細(xì)胞相比，兩者沒有顯著性差異(F=

12、0.001，P=0.973)，說明FE-PLL標(biāo)記對細(xì)胞周期沒有明顯的影響。 FE-PLL復(fù)合物對細(xì)胞端粒酶表達(dá)和活性的影響：TERT免疫細(xì)胞化學(xué)染色顯示，可見對數(shù)生長期的標(biāo)記細(xì)胞和未標(biāo)記細(xì)胞都呈陽性反應(yīng)，胞質(zhì)內(nèi)可見棕黃色的陽性顆粒。酶聯(lián)免疫檢測儀檢測，標(biāo)記組和正常組相比，OD值沒有顯著性差異(F=591.091，P＜0.001)。 FE-PLL復(fù)合對細(xì)胞增殖或分化的影響：在含F(xiàn)E-PLL復(fù)合物的培養(yǎng)基中BMSCs可繼續(xù)

13、增殖和分化，細(xì)胞形態(tài)沒有發(fā)生明顯的變化。BMSCs增殖分裂和分化后普魯士藍(lán)染色仍為陽性，增殖分裂后的BMSCs細(xì)胞質(zhì)內(nèi)鐵顆粒數(shù)量較增殖前變少。 FE-PLL對細(xì)胞凋亡的影響：熒光顯微鏡下，Hoechst33258核染色結(jié)果顯示，F(xiàn)E-PLL標(biāo)記后培養(yǎng)不同時間的標(biāo)記細(xì)胞和相同時間點的未標(biāo)記細(xì)胞，絕大多數(shù)細(xì)胞核形態(tài)正常，呈圓形或橢圓形，淡藍(lán)色熒光。標(biāo)記細(xì)胞和未標(biāo)記細(xì)胞都可見到少數(shù)細(xì)胞發(fā)生凋亡現(xiàn)象，即胞核致密亮藍(lán)色濃染，或呈碎塊狀致密

14、濃染。電鏡下絕大多數(shù)標(biāo)記細(xì)胞和正常細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)形態(tài)正常。流式細(xì)胞儀檢測顯示，F(xiàn)E-PLL標(biāo)記組細(xì)胞和正常組細(xì)胞隨著培養(yǎng)時間的延長細(xì)胞凋亡有增加的趨勢，但相同時間點兩組細(xì)胞相比差異不顯著性(F=0.921，P=0.340)。 結(jié)論：FE-PLL復(fù)合物可以用來體外標(biāo)記恒河猴骨髓基質(zhì)細(xì)胞。應(yīng)用FE-PLL復(fù)合物標(biāo)記恒河猴骨髓基質(zhì)細(xì)胞安全、有效。 第三章菲立磁標(biāo)記恒河猴骨髓基質(zhì)源神經(jīng)干細(xì)胞自體移植入紋狀體后活體磁共振示蹤和形態(tài)學(xué)

15、觀察 目的：將體外菲立磁標(biāo)記的骨髓基質(zhì)細(xì)胞經(jīng)單細(xì)胞懸液微移植后，觀察其在恒河猴紋狀體的存活、遷移、分化和整合狀況，為細(xì)胞移植治療疾病奠定基礎(chǔ)。 方法：分離恒河猴骨髓基質(zhì)細(xì)胞，利用神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基、白血病抑止因子和堿性成纖維細(xì)胞生長因子進行細(xì)胞擴增并誘導(dǎo)成骨髓基質(zhì)源神經(jīng)干細(xì)胞，再經(jīng)體外菲立磁和活細(xì)胞熒光染料PKH67標(biāo)記后，采用微移植的方法，通過腦立體定位儀用微玻璃針將干細(xì)胞分別植入腦紋狀體內(nèi)。細(xì)胞移植后1，4，8周應(yīng)用核

16、磁共振成像對腦內(nèi)移植的細(xì)胞進行活體示蹤，最后利用光鏡和電鏡觀察標(biāo)記細(xì)胞在腦內(nèi)的形態(tài)學(xué)情況。 結(jié)果：體外菲立磁和PKH67標(biāo)記結(jié)果：普魯士藍(lán)染色顯示99％以上的Feridex標(biāo)記的骨髓基質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)細(xì)小的藍(lán)色鐵顆粒；PKH67處理2h后，經(jīng)熒光顯微鏡檢查99％以上的骨髓基質(zhì)細(xì)胞胞膜都被綠色熒光標(biāo)記。 磁共振檢查：術(shù)后第1，4及8周分別行核磁共振成像檢查，SET1WI序列可見左側(cè)移植FE-PLL標(biāo)記干細(xì)胞的紋狀體區(qū)域可

17、見信號輕度升高，SET2WI、FSET2WI和GRET2*WI序列檢查紋狀體區(qū)域則呈現(xiàn)不同程度的低信號改變，右側(cè)未標(biāo)記細(xì)胞側(cè)腦組織無明顯的低信號改變。T2WI掃描序列信號較T1WI明顯，其中GRET2*WI序列低信號相對下降明顯。 組織學(xué)檢查：鏡下觀察表明細(xì)胞移植局部無明顯的組織損傷，很容易發(fā)現(xiàn)移植部位存活的細(xì)胞。左側(cè)移植區(qū)內(nèi)，顯微鏡下普魯士蘭染色顯示標(biāo)記細(xì)胞胞漿呈藍(lán)色染色，熒光顯微光。細(xì)胞移植1，4，8周時的組織學(xué)改變基本上與