脂肪源性神經(jīng)干細胞移植治療老年性聾的實驗研究.pdf

1、老年性聾也稱年齡相關性聽力損失(ARHL)，是指因年齡的增長，聽覺器官隨同身體其他組織器官一起所發(fā)生的緩慢進行性聽覺系統(tǒng)老化過程，并出現(xiàn)聽力減退的生理現(xiàn)象，屬于多基因疾病范疇，是遺傳和環(huán)境因素共同作用的結果。隨著世界人口老齡化趨勢的不斷加劇，老年性聾的發(fā)病率逐年增高。據(jù)WHO統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示：到2025年，老年人口比例迅速增加，全世界60歲以上的人口將達12億之多，而其中65～75歲的人老年性聾的發(fā)病率為70%～80%。老年性聾的發(fā)生和發(fā)展

2、嚴重影響老年患者的生活質(zhì)量。隨著老年性聾發(fā)病機制研究的日益深入，Welsh在Schuknecht對老年性聾分類的基礎上又提出了中樞性老年性聾這一概念，是指各級中樞尤其是大腦初級聽皮層神經(jīng)元凋亡及退行性變是老年性聾的主要發(fā)病機制。近年來，為了挽救老年性聾患者的聽力，嘗試了干細胞移植、藥理學干預療法及基因治療等多種方法，而干細胞移植治療是目前具有極大潛在臨床應用價值的治療方法。
　　 Kesser等人不僅使移植到耳蝸的神經(jīng)干細胞(n

3、eural stem cells，NSCs)分化為毛細胞或螺旋神經(jīng)節(jié)細胞來替代甚至修復外周神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)生凋亡和退行性變的細胞，而且提出種子細胞是通過釋放GDNF和BDNF等神經(jīng)營養(yǎng)因子來發(fā)揮作用，提示了神經(jīng)干細胞在老年性聾等神經(jīng)退行性疾病干細胞移植治療中發(fā)揮了重要作用。目前用于老年性聾移植的細胞主要來源于胚胎期的紋狀體、海馬、腦皮層、側腦室的腦室區(qū)，但人胚胎組織和人胚胎干細胞的使用始終存在倫理學限制而來源不足，并且異體移植或多或少會存在免

4、疫排斥問題。脂肪源性干細胞(Adipose derived stem cells，ADSCs)可在一定程度上克服上述缺點因此被認為是理想的種子細胞來源。ADSCs可以通過自體取材獲得，且具有分離培養(yǎng)較為容易，排斥反應較弱，無致瘤性等特點，已成為一種極有潛力的成體干細胞。
　　 針對老年性聾外周神經(jīng)系統(tǒng)的干細胞移植治療雖能證實種子細胞可替代丟失的細胞，但移植動物的聽功能恢復情況尚不明確?；谀壳按罅垦芯勘砻骼夏晷悦@的發(fā)生是外周神經(jīng)

5、系統(tǒng)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)聯(lián)合降低衰變的結果，以中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元的凋亡和退行性變?yōu)橹?。本研究將ADSCs在特定生長因子的作用下誘導分化為NSCs后移植到老年性聾動物模型C57BL/6J小鼠初級聽皮層，觀察此方法對ADSCs向NSCs誘導分化的影響。應用透射電鏡技術、HE染色法和Tunel-POD法比較年輕組(2月齡)和老年組(10月齡)小鼠干細胞治療前初級聽皮層形態(tài)學差異及治療前后初級聽皮層神經(jīng)元凋亡率的變化。在此基礎上應用免疫組織熒光技術檢

6、測移植的種子細胞在受體組織中的存活、遷移和分化程度，并進一步檢測了小鼠聽功能恢復情況。本研究分為三個部分：
　　 第一部分C57BL/6J小鼠脂肪源性干細胞的分離、培養(yǎng)及鑒定
　　 [目的]嚴格無菌條件下分離得到C57BL/6J小鼠附睪脂肪墊組織，進行ADSCs體外培養(yǎng)和鑒定，探索新的干細胞移植治療來源。
　　 [方法]選取體重約15g～16g的C57BL/6J小鼠，切開腹部皮膚后獲取附睪脂肪墊組織，Ⅰ型膠原酶消

7、化法分離、貼壁培養(yǎng)得到ADSCs，胰蛋白酶消化法傳代擴增。傳至第三代的ADSCs分別行流式細胞學檢測細胞表型(CD45，CD90，CD105)及免疫熒光技術檢測其特異性標志物纖連蛋白(fibronectin)。
　　 [結果]附睪脂肪墊組織在體外貼壁培養(yǎng)能夠得到大量長梭形ADSCs，經(jīng)傳代后仍具有較強的增殖能力；細胞表面標志物CD90、CD105表達強陽性，CD45表達陰性；經(jīng)fibronectin鑒定為ADSCs。
　　

8、 [結論]附睪脂肪墊組織在體外貼壁培養(yǎng)可獲得大量ADSCs，易于傳代擴增，可作為新的干細胞移植治療的種子來源。
　　 第二部分脂肪源性干細胞誘導分化為神經(jīng)干細胞的體外研究
　　 [目的]探討誘導ADSCs分化為NSCs的體外培養(yǎng)方法，為細胞移植修復神經(jīng)系統(tǒng)損傷及退行性變提供種子細胞。
　　 [方法]貼壁培養(yǎng)的C57BL/6J小鼠(附睪脂肪墊)ADSCs，進行流式細胞術表型鑒定及標志物fibronectin鑒定后

9、，在堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)、表皮生長因子(EGF)、2% B27的Neurobasal培養(yǎng)基中誘導成NSCs。用免疫熒光技術進行NSCs特異性標記物巢蛋白(Nestin)、增殖能力5’-溴尿嘧啶(BrdU)及多向分化潛能檢測。
　　 [結果]誘導后的干細胞球經(jīng)Nestin及Brdu鑒定為NSCs，且具有較強的增殖能力；NSCs在體外分化后產(chǎn)生β微管蛋白(β-TubulinⅢ)陽性的神經(jīng)元以及膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP

10、)陽性的星形膠質(zhì)細胞。
　　 [結論]ADSCs可在特定生長因子作用下被成功誘導為NSCs，為細胞移植修復神經(jīng)系統(tǒng)損傷及退行性變奠定了基礎。
　　 第三部分脂肪源性神經(jīng)干細胞移植治療老年性聾的體內(nèi)研究
　　 [目的]脂肪源性神經(jīng)干細胞移植治療老年性聾動物模型C57BL/6J小鼠后，種子細胞在體內(nèi)的存活、遷移及分化情況及對C57BL/6J小鼠聽覺功能的影響。
　　 [方法]ADSCs誘導而來的NSCs立體定

11、向注射入年輕組和老年組C57BL/6J小鼠初級聽皮層，注射后從免疫熒光化學、病理學、電生理學方面分別檢測ADSCs誘導而來的NSCs在體內(nèi)的存活及分化情況、注射前及注射后2w、3w、4w，Tunel-POD法檢測初級聽皮層神經(jīng)元凋亡情況、聽性腦干反應(ABR)檢測小鼠聽功能變化。
　　 [結果]C57BL/6J小鼠進行脂肪源性神經(jīng)干細胞移植治療后2w、3w種子細胞可在體內(nèi)存活并分化為β微管蛋白(β-TubulinⅢ)陽性的神經(jīng)元

12、，但是第3w以后存活細胞數(shù)量逐漸減少，至第四周時已基本檢測不到移植細胞；老年組治療后初級聽皮層神經(jīng)元凋亡率較治療前明顯減少、治療后2w、3w聽功能較治療前有較明顯提高，但治療3w后聽力提高差異不大甚至有所下降至第4w時已無差異；年輕組小鼠治療前后初級聽皮層神經(jīng)元凋亡率及聽功能較治療前無顯著差異。
　　 [結論]脂肪源性神經(jīng)干細胞通過在體內(nèi)分化以替代和修復老年性聾動物模型C57BL/6J小鼠初級聽皮層凋亡神經(jīng)元而促進老年性聾小鼠聽