脂肪源性神經(jīng)干細(xì)胞移植治療老年性聾的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、老年性聾也稱年齡相關(guān)性聽力損失(ARHL)，是指因年齡的增長(zhǎng)，聽覺器官隨同身體其他組織器官一起所發(fā)生的緩慢進(jìn)行性聽覺系統(tǒng)老化過(guò)程，并出現(xiàn)聽力減退的生理現(xiàn)象，屬于多基因疾病范疇，是遺傳和環(huán)境因素共同作用的結(jié)果。隨著世界人口老齡化趨勢(shì)的不斷加劇，老年性聾的發(fā)病率逐年增高。據(jù)WHO統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示：到2025年，老年人口比例迅速增加，全世界60歲以上的人口將達(dá)12億之多，而其中65～75歲的人老年性聾的發(fā)病率為70%～80%。老年性聾的發(fā)生和發(fā)展

2、嚴(yán)重影響老年患者的生活質(zhì)量。隨著老年性聾發(fā)病機(jī)制研究的日益深入，Welsh在Schuknecht對(duì)老年性聾分類的基礎(chǔ)上又提出了中樞性老年性聾這一概念，是指各級(jí)中樞尤其是大腦初級(jí)聽皮層神經(jīng)元凋亡及退行性變是老年性聾的主要發(fā)病機(jī)制。近年來(lái)，為了挽救老年性聾患者的聽力，嘗試了干細(xì)胞移植、藥理學(xué)干預(yù)療法及基因治療等多種方法，而干細(xì)胞移植治療是目前具有極大潛在臨床應(yīng)用價(jià)值的治療方法。
　　 Kesser等人不僅使移植到耳蝸的神經(jīng)干細(xì)胞(n

3、eural stem cells，NSCs)分化為毛細(xì)胞或螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞來(lái)替代甚至修復(fù)外周神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)生凋亡和退行性變的細(xì)胞，而且提出種子細(xì)胞是通過(guò)釋放GDNF和BDNF等神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子來(lái)發(fā)揮作用，提示了神經(jīng)干細(xì)胞在老年性聾等神經(jīng)退行性疾病干細(xì)胞移植治療中發(fā)揮了重要作用。目前用于老年性聾移植的細(xì)胞主要來(lái)源于胚胎期的紋狀體、海馬、腦皮層、側(cè)腦室的腦室區(qū)，但人胚胎組織和人胚胎干細(xì)胞的使用始終存在倫理學(xué)限制而來(lái)源不足，并且異體移植或多或少會(huì)存在免

4、疫排斥問(wèn)題。脂肪源性干細(xì)胞(Adipose derived stem cells，ADSCs)可在一定程度上克服上述缺點(diǎn)因此被認(rèn)為是理想的種子細(xì)胞來(lái)源。ADSCs可以通過(guò)自體取材獲得，且具有分離培養(yǎng)較為容易，排斥反應(yīng)較弱，無(wú)致瘤性等特點(diǎn)，已成為一種極有潛力的成體干細(xì)胞。
　　 針對(duì)老年性聾外周神經(jīng)系統(tǒng)的干細(xì)胞移植治療雖能證實(shí)種子細(xì)胞可替代丟失的細(xì)胞，但移植動(dòng)物的聽功能恢復(fù)情況尚不明確。基于目前大量研究表明老年性聾的發(fā)生是外周神經(jīng)

5、系統(tǒng)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)聯(lián)合降低衰變的結(jié)果，以中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元的凋亡和退行性變?yōu)橹?。本研究將ADSCs在特定生長(zhǎng)因子的作用下誘導(dǎo)分化為NSCs后移植到老年性聾動(dòng)物模型C57BL/6J小鼠初級(jí)聽皮層，觀察此方法對(duì)ADSCs向NSCs誘導(dǎo)分化的影響。應(yīng)用透射電鏡技術(shù)、HE染色法和Tunel-POD法比較年輕組(2月齡)和老年組(10月齡)小鼠干細(xì)胞治療前初級(jí)聽皮層形態(tài)學(xué)差異及治療前后初級(jí)聽皮層神經(jīng)元凋亡率的變化。在此基礎(chǔ)上應(yīng)用免疫組織熒光技術(shù)檢

6、測(cè)移植的種子細(xì)胞在受體組織中的存活、遷移和分化程度，并進(jìn)一步檢測(cè)了小鼠聽功能恢復(fù)情況。本研究分為三個(gè)部分：
　　 第一部分C57BL/6J小鼠脂肪源性干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)及鑒定
　　 [目的]嚴(yán)格無(wú)菌條件下分離得到C57BL/6J小鼠附睪脂肪墊組織，進(jìn)行ADSCs體外培養(yǎng)和鑒定，探索新的干細(xì)胞移植治療來(lái)源。
　　 [方法]選取體重約15g～16g的C57BL/6J小鼠，切開腹部皮膚后獲取附睪脂肪墊組織，Ⅰ型膠原酶消

7、化法分離、貼壁培養(yǎng)得到ADSCs，胰蛋白酶消化法傳代擴(kuò)增。傳至第三代的ADSCs分別行流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)細(xì)胞表型(CD45，CD90，CD105)及免疫熒光技術(shù)檢測(cè)其特異性標(biāo)志物纖連蛋白(fibronectin)。
　　 [結(jié)果]附睪脂肪墊組織在體外貼壁培養(yǎng)能夠得到大量長(zhǎng)梭形ADSCs，經(jīng)傳代后仍具有較強(qiáng)的增殖能力；細(xì)胞表面標(biāo)志物CD90、CD105表達(dá)強(qiáng)陽(yáng)性，CD45表達(dá)陰性；經(jīng)fibronectin鑒定為ADSCs。
　　

8、 [結(jié)論]附睪脂肪墊組織在體外貼壁培養(yǎng)可獲得大量ADSCs，易于傳代擴(kuò)增，可作為新的干細(xì)胞移植治療的種子來(lái)源。
　　 第二部分脂肪源性干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為神經(jīng)干細(xì)胞的體外研究
　　 [目的]探討誘導(dǎo)ADSCs分化為NSCs的體外培養(yǎng)方法，為細(xì)胞移植修復(fù)神經(jīng)系統(tǒng)損傷及退行性變提供種子細(xì)胞。
　　 [方法]貼壁培養(yǎng)的C57BL/6J小鼠(附睪脂肪墊)ADSCs，進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)表型鑒定及標(biāo)志物fibronectin鑒定后

9、，在堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)、表皮生長(zhǎng)因子(EGF)、2% B27的Neurobasal培養(yǎng)基中誘導(dǎo)成NSCs。用免疫熒光技術(shù)進(jìn)行NSCs特異性標(biāo)記物巢蛋白(Nestin)、增殖能力5’-溴尿嘧啶(BrdU)及多向分化潛能檢測(cè)。
　　 [結(jié)果]誘導(dǎo)后的干細(xì)胞球經(jīng)Nestin及Brdu鑒定為NSCs，且具有較強(qiáng)的增殖能力；NSCs在體外分化后產(chǎn)生β微管蛋白(β-TubulinⅢ)陽(yáng)性的神經(jīng)元以及膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP

10、)陽(yáng)性的星形膠質(zhì)細(xì)胞。
　　 [結(jié)論]ADSCs可在特定生長(zhǎng)因子作用下被成功誘導(dǎo)為NSCs，為細(xì)胞移植修復(fù)神經(jīng)系統(tǒng)損傷及退行性變奠定了基礎(chǔ)。
　　 第三部分脂肪源性神經(jīng)干細(xì)胞移植治療老年性聾的體內(nèi)研究
　　 [目的]脂肪源性神經(jīng)干細(xì)胞移植治療老年性聾動(dòng)物模型C57BL/6J小鼠后，種子細(xì)胞在體內(nèi)的存活、遷移及分化情況及對(duì)C57BL/6J小鼠聽覺功能的影響。
　　 [方法]ADSCs誘導(dǎo)而來(lái)的NSCs立體定

11、向注射入年輕組和老年組C57BL/6J小鼠初級(jí)聽皮層，注射后從免疫熒光化學(xué)、病理學(xué)、電生理學(xué)方面分別檢測(cè)ADSCs誘導(dǎo)而來(lái)的NSCs在體內(nèi)的存活及分化情況、注射前及注射后2w、3w、4w，Tunel-POD法檢測(cè)初級(jí)聽皮層神經(jīng)元凋亡情況、聽性腦干反應(yīng)(ABR)檢測(cè)小鼠聽功能變化。
　　 [結(jié)果]C57BL/6J小鼠進(jìn)行脂肪源性神經(jīng)干細(xì)胞移植治療后2w、3w種子細(xì)胞可在體內(nèi)存活并分化為β微管蛋白(β-TubulinⅢ)陽(yáng)性的神經(jīng)元

12、，但是第3w以后存活細(xì)胞數(shù)量逐漸減少，至第四周時(shí)已基本檢測(cè)不到移植細(xì)胞；老年組治療后初級(jí)聽皮層神經(jīng)元凋亡率較治療前明顯減少、治療后2w、3w聽功能較治療前有較明顯提高，但治療3w后聽力提高差異不大甚至有所下降至第4w時(shí)已無(wú)差異；年輕組小鼠治療前后初級(jí)聽皮層神經(jīng)元凋亡率及聽功能較治療前無(wú)顯著差異。
　　 [結(jié)論]脂肪源性神經(jīng)干細(xì)胞通過(guò)在體內(nèi)分化以替代和修復(fù)老年性聾動(dòng)物模型C57BL/6J小鼠初級(jí)聽皮層凋亡神經(jīng)元而促進(jìn)老年性聾小鼠聽