TH基因修飾骨髓基質(zhì)細(xì)胞源神經(jīng)干細(xì)胞自體移植治療恒河猴帕金森病模型.pdf

1、目的:該研究采用分子克隆、骨髓源神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)和腦立體定向細(xì)胞移植等實(shí)驗(yàn)技術(shù),將hTH基因分別構(gòu)建入pEGFP-C2和pcDNA3.1His真核表達(dá)載體中,構(gòu)建了pEGFP-C2-hTH和pcDNA3.1His-hTH.同時(shí),純化提取pEGFP-C2質(zhì)粒,酶切鑒定后分別轉(zhuǎn)入培養(yǎng)的骨髓源性神經(jīng)干細(xì)胞,體外進(jìn)行其基因表達(dá)情況的觀察,證實(shí)成功表達(dá)后,將轉(zhuǎn)染的骨髓源性神經(jīng)干細(xì)胞定向注射入經(jīng)右頸總動(dòng)脈注射MPTP制作的偏側(cè)恒河猴帕金森病模型的尾狀

2、核頭部和黑質(zhì)部位.移植后定期觀察恒河猴的動(dòng)作行為變化.5個(gè)月后行頭部<'18>F-FDG PET、MRI和<'99m>Tc-TRODAT-1SPECT檢查,分別觀察細(xì)胞移植后腦內(nèi)的代謝、結(jié)構(gòu)和腦內(nèi)DA能神經(jīng)元的分布.最后,免疫組織化學(xué)觀察移植細(xì)胞的分布情況.結(jié)論:該研究采用分子克隆技術(shù)成功構(gòu)建了pEGFP-C2-hTH和pcDNA3.1His-hTH、純化并提取了pEGFP-C2真核表達(dá)表達(dá)質(zhì)粒.應(yīng)用Nucleofector<'TM>核

3、轉(zhuǎn)染技術(shù)成功地將His、hTH和EGFP基因轉(zhuǎn)入體外培養(yǎng)的骨髓源神經(jīng)干細(xì)胞.所培養(yǎng)的細(xì)胞表達(dá)Nestin和CD133抗原,并能分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞和膠質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞,免疫細(xì)胞化學(xué)檢測可見NSE、GFAP和β-tublin抗原陽性表達(dá).而后應(yīng)用RT-PCR、免疫細(xì)胞化學(xué)等技術(shù)對(duì)基因修飾細(xì)胞進(jìn)行目的基因表達(dá)情況的測定,發(fā)現(xiàn)目的基因都有效長期表達(dá).隨后應(yīng)用腦立體定向細(xì)胞移植技術(shù)將基因修飾細(xì)胞自體移植入偏側(cè)恒河猴帕金森病模型的尾狀核頭部和黑質(zhì)部位.

4、通過術(shù)后阿撲嗎啡誘導(dǎo)、<'18>F-FDG PET、MRI和<'99m>Tc-TRODAT-1 SPECT檢測發(fā)現(xiàn)細(xì)胞移植后對(duì)動(dòng)物的PD行為有所緩解,較模型猴腦內(nèi)代謝有所改善、右側(cè)黑質(zhì)-紋狀體區(qū)DA能神經(jīng)元有所增加,移植區(qū)域的結(jié)構(gòu)也有相應(yīng)改變.細(xì)胞移植6個(gè)月后免疫組織化學(xué)顯示TH免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞數(shù)量有相應(yīng)增加,而且EGFP、His和Brdu標(biāo)記明確地顯示出移植細(xì)胞的分布和遷移情況,能有效地與自身細(xì)胞進(jìn)行區(qū)分,為下一步骨髓源神經(jīng)干細(xì)胞自體