抗菌肽LL-37的原核表達(dá)純化及對(duì)外陰陰道假絲酵母菌病的療效研究.pdf

1、目的:通過(guò)構(gòu)建LL-37原核表達(dá)載體，優(yōu)化表達(dá)條件，純化獲得具有生物活性的LL-37重組蛋白。通過(guò)細(xì)胞及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，探討重組LL-37蛋白對(duì)外陰陰道假絲酵母菌病(VVC)的療效及作用機(jī)制。
　　方法:1）通過(guò)基因工程構(gòu)建LL-37原核表達(dá)載體pET-Duet/LL-37。轉(zhuǎn)化入大腸桿菌(Ecoli)M15菌株后，異丙基-D-硫代半乳糖苷(IPTG)進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。通過(guò)調(diào)控誘導(dǎo)劑濃度及誘導(dǎo)時(shí)間優(yōu)化誘導(dǎo)條件。經(jīng)鎳離子金屬螯合(NI-IDA

2、)親和層析純化蛋白并進(jìn)行蛋白復(fù)性，BCA法測(cè)定純化蛋白濃度。KB紙片法初步驗(yàn)證純化蛋白的抗真菌活性。2）分步消化法原代培養(yǎng)人陰道上皮細(xì)胞，傳至第4代進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。將陰道上皮細(xì)胞與假絲酵母菌按1∶1共培養(yǎng)，構(gòu)建VVC細(xì)胞模型，分對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組。實(shí)驗(yàn)組加入純化LL-37蛋白進(jìn)后繼續(xù)培養(yǎng)，對(duì)照組加入等量PBS溶液。分別于12h、24h、48h收集各組上清液。倒置顯微鏡觀察兩組不同時(shí)間段陰道上皮細(xì)胞及假絲酵母菌生長(zhǎng)情況，采用葡萄糖消耗法比較兩組抑菌

3、效果（以吸光度A值表示）;酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)兩組不同時(shí)間段IFN-γ、 IL-10濃度及IFN-γ/IL-10比值的變化。3）通過(guò)定期雌激素皮下注射，構(gòu)建小鼠VVC模型。將30只雌性昆明小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組。實(shí)驗(yàn)組在成模后每天陰道灌入LL-37進(jìn)行治療連續(xù)5天，對(duì)照組以PBS溶液灌洗。5天后取小鼠陰道灌洗液及陰道壁組織，比較兩組灌洗液涂片情況及載菌量變化。ELISA檢測(cè)陰道壁組織勻漿中IL-10、IFN-γ濃度，比

4、較兩組IFN-γ/IL-10比值的變化。
　　結(jié)果:1）成功構(gòu)建pET-Duet/LL-37表達(dá)載體。重組蛋白主要以包涵體形式表達(dá)。優(yōu)化表達(dá)條件:IPTG0.5mmol/l，誘導(dǎo)時(shí)間6小時(shí)。純化得到濃度為433.92ug/ml，純度可達(dá)96％的重組蛋白。KB紙片法證實(shí)純化蛋白具有一定的抗真菌活性。2）成功構(gòu)建VVC細(xì)胞模型。隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，對(duì)照組可見(jiàn)假絲酵母菌生長(zhǎng)旺盛，吸光度呈明顯下降趨勢(shì)。實(shí)驗(yàn)組陰道上皮細(xì)胞存活情況好于對(duì)照組，

5、假絲酵母菌生長(zhǎng)明顯受到抑制。各時(shí)間段吸光度值均高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，并且下降趨勢(shì)較對(duì)照組緩慢。ELISA結(jié)果顯示，兩組IFN-γ、 IL-10分泌水平均呈現(xiàn)先升后降的趨勢(shì)，于24h達(dá)高峰。各時(shí)間段比較，實(shí)驗(yàn)組IFN-γ濃度于24h時(shí)明顯高于對(duì)照組(p＜0.05)，其他時(shí)間段則無(wú)明顯差異。各時(shí)間段IL-10濃度均低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且IFN-γ/IL-10比值均高于對(duì)照組，差異明顯。同組內(nèi)各時(shí)間段IFN-γ/IL-10比

6、較，無(wú)明顯差異。3）成功構(gòu)建VVC小鼠模型。實(shí)驗(yàn)組陰道灌洗液涂片中菌絲及孢子含量明顯低于對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組灌洗液載菌量明顯低于對(duì)照組(p＜0.05)。ELISA結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組IFN-γ濃度較對(duì)照組升高(p＜0.01)，IL-10濃度降低(p＜0.01)，IFN-γ/IL-10比值則明顯升高(p＜0.05)。
　　結(jié)論:1）成功構(gòu)建了LL-37的原核表達(dá)載體，并純化獲得具有抗真菌活性的重組蛋白。2）細(xì)胞及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均證實(shí)，重組LL-37