中國林蛙抗菌肽分離鑒定、cDNA克隆及其原核表達載體的構建.pdf

1、吉林農業(yè)大學碩士學位論文中國林蛙抗菌肽分離鑒定、cDNA克隆及其原核表達載體的構建姓名：霍芳申請學位級別：碩士專業(yè)：食品科學指導教師：胡耀輝20070501為模板，采用3 ’R A C E ( R a p i d A m p l i f i c a t i o nO f c D N A E n d s ) 技術進行中國林蛙抗菌肽基因的c D N A 克隆，測序分析。同時，運用生物信息學軟件對其全長e D N A 序列進行閱讀框架、同源性

2、比較和相關的生物學功能分析。( 5 ) 根據e D N A 克隆所獲得的中國林蛙抗菌肽基因中編碼成熟肽的序列設計合成引物，以全長e D N A 序列為模板，通過P C R 擴增，獲得帶有限制性酶切位點的目的片段。( 6 ) 采用T ／A 克隆法將目的序列插, 入p N I D l 8 - T s i m p l e 克隆載體，測序，正確后將酶切的目的序列亞克隆至經相應限制性內切酶消化處理的原核表達載體p G E X - 3 X 上，構建

3、原核重組表達載體。將重組表達質粒轉化至大腸桿菌B L 2 1 感受態(tài)細胞中，用彤I ．G 進行誘導表達，采用S D S - P A G E 電泳進行分析檢測。結果： ( 1 ) 應用R A C E 技術成功的獲得了一條中國林蛙抗菌肽基因的全長c D N A 序列。序列全長為2 9 7 b p ，其中包括2 1 3 b p 完整的開放閱讀框( o p e n r e a d i n g f r a m e O R F ) ，含有8 4 b

4、 p 的3 ’非轉譯區(qū)( 3 ’U T R ) ，推測編碼7 1 個氨基酸的多肽，分子量( M W ) 為7 8 1 0 ．9 D a ，等電點( p I ) 為5 ．0 8 。經生物信息學分析表明，中國林蛙C A M P s - 3 氨基酸序列N 末端均含有一個相對保守的由2 2 個氨基酸組成的信號肽( s i g n l ep e p t i d e ) 序列，還包含有一個拷貝由個3 3 氨基酸組成的成熟肽( m a t u r e

5、 p e p t i d e ) ，在信號肽和成熟體之間，是一段富含酸性氨基酸的酸性間隔序列( a c i d i c s p a c e rd o m a i n ) 。經同源性分析，在氨基酸水平的同源性高于核苷酸水平的同源性，該序列已被G c n B a n K 收錄，登錄號為D Q 6 7 3 1 0 5 ．( 2 ) 將編碼成熟肽的目的序列亞克隆至p M D I S - T s i m p l e 克隆載體中，經測序顯示其編碼氨

6、基酸序列與原始序列完全一致。將酶切后的目的序列插入P G E X - 3 X 原核表達載體中構建重組表達質粒p G E X - c h e n s i r i n - 3 ，經I P T G 誘導后。表達出相對分子質量為3 0 k D a 的G S T 融合蛋白．結論： ( 1 ) 從中國林蛙皮膚組織中分離出一條新的編碼抗茵肽前體C A M P s ·3 的全長c D N A序列，經N C B I 網站中的b l a s t

7、p 服務器分析發(fā)現與r a n a m e f i n 和b r e v i n i n 家族抗菌肽具有較高的同源性，分別為9 0 ％- 7 2 ％，7 0 ％- 5 3 ％。( 2 ) 成功的構建重組融合蛋白表達質粒p G E X - c h e n s i r i n - 3 ，經誘導，表達出分子量為3 0 k D a 融合蛋白。為迸一步研究兩棲類抗菌肽的抑菌機制及高效表達奠定了基礎．關鍵詞；中國林蛙抗菌肽e D N A 克隆重組質