中國林蛙抗菌肽分離鑒定、cDNA克隆及其原核表達(dá)載體的構(gòu)建.pdf

1、吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文中國林蛙抗菌肽分離鑒定、cDNA克隆及其原核表達(dá)載體的構(gòu)建姓名：霍芳申請學(xué)位級別：碩士專業(yè)：食品科學(xué)指導(dǎo)教師：胡耀輝20070501為模板，采用3 ’R A C E ( R a p i d A m p l i f i c a t i o nO f c D N A E n d s ) 技術(shù)進(jìn)行中國林蛙抗菌肽基因的c D N A 克隆，測序分析。同時，運(yùn)用生物信息學(xué)軟件對其全長e D N A 序列進(jìn)行閱讀框架、同源性

2、比較和相關(guān)的生物學(xué)功能分析。( 5 ) 根據(jù)e D N A 克隆所獲得的中國林蛙抗菌肽基因中編碼成熟肽的序列設(shè)計(jì)合成引物，以全長e D N A 序列為模板，通過P C R 擴(kuò)增，獲得帶有限制性酶切位點(diǎn)的目的片段。( 6 ) 采用T ／A 克隆法將目的序列插, 入p N I D l 8 - T s i m p l e 克隆載體，測序，正確后將酶切的目的序列亞克隆至經(jīng)相應(yīng)限制性內(nèi)切酶消化處理的原核表達(dá)載體p G E X - 3 X 上，構(gòu)建

3、原核重組表達(dá)載體。將重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌B L 2 1 感受態(tài)細(xì)胞中，用彤I ．G 進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，采用S D S - P A G E 電泳進(jìn)行分析檢測。結(jié)果： ( 1 ) 應(yīng)用R A C E 技術(shù)成功的獲得了一條中國林蛙抗菌肽基因的全長c D N A 序列。序列全長為2 9 7 b p ，其中包括2 1 3 b p 完整的開放閱讀框( o p e n r e a d i n g f r a m e O R F ) ，含有8 4 b

4、 p 的3 ’非轉(zhuǎn)譯區(qū)( 3 ’U T R ) ，推測編碼7 1 個氨基酸的多肽，分子量( M W ) 為7 8 1 0 ．9 D a ，等電點(diǎn)( p I ) 為5 ．0 8 。經(jīng)生物信息學(xué)分析表明，中國林蛙C A M P s - 3 氨基酸序列N 末端均含有一個相對保守的由2 2 個氨基酸組成的信號肽( s i g n l ep e p t i d e ) 序列，還包含有一個拷貝由個3 3 氨基酸組成的成熟肽( m a t u r e

5、 p e p t i d e ) ，在信號肽和成熟體之間，是一段富含酸性氨基酸的酸性間隔序列( a c i d i c s p a c e rd o m a i n ) 。經(jīng)同源性分析，在氨基酸水平的同源性高于核苷酸水平的同源性，該序列已被G c n B a n K 收錄，登錄號為D Q 6 7 3 1 0 5 ．( 2 ) 將編碼成熟肽的目的序列亞克隆至p M D I S - T s i m p l e 克隆載體中，經(jīng)測序顯示其編碼氨

6、基酸序列與原始序列完全一致。將酶切后的目的序列插入P G E X - 3 X 原核表達(dá)載體中構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒p G E X - c h e n s i r i n - 3 ，經(jīng)I P T G 誘導(dǎo)后。表達(dá)出相對分子質(zhì)量為3 0 k D a 的G S T 融合蛋白．結(jié)論： ( 1 ) 從中國林蛙皮膚組織中分離出一條新的編碼抗茵肽前體C A M P s ·3 的全長c D N A序列，經(jīng)N C B I 網(wǎng)站中的b l a s t

7、p 服務(wù)器分析發(fā)現(xiàn)與r a n a m e f i n 和b r e v i n i n 家族抗菌肽具有較高的同源性，分別為9 0 ％- 7 2 ％，7 0 ％- 5 3 ％。( 2 ) 成功的構(gòu)建重組融合蛋白表達(dá)質(zhì)粒p G E X - c h e n s i r i n - 3 ，經(jīng)誘導(dǎo)，表達(dá)出分子量為3 0 k D a 融合蛋白。為迸一步研究兩棲類抗菌肽的抑菌機(jī)制及高效表達(dá)奠定了基礎(chǔ)．關(guān)鍵詞；中國林蛙抗菌肽e D N A 克隆重組質(zhì)