肝癌c-Met表達異常與索拉非尼耐藥關系研究及肝癌動物模型建立.pdf

1、第一部分肝細胞性肝癌患者HGF/c-Met表達特征評價
　　目的：檢測原發(fā)性肝細胞性肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)患者血清肝細胞生長因子(hepatocyte growth factor，HGF)水平及HCC組織c-Met蛋白表達水平。
　　方法：通過雙抗體夾心酶聯(lián)免疫ELISA方法檢測血清標本中HGF水平，通過免疫組織化學方法檢測肝臟病理標本c-Met蛋白染色強度。對肝癌組與肝硬化組及健康

2、人群組在HGF水平、c-Met染色強度等變量進行One-Way ANOVA統(tǒng)計分析和Friedman非參數檢驗，評價肝癌組與其他兩組間是否存在顯著性差異。
　　結果：血清HGF濃度在肝癌組、肝硬化組和正常對照組分別為0.609±0.134ng/ml、0.378±0.116ng/ml、0.271±0.083n/ml，肝癌組患者血清HGF水平明顯高于肝硬化組和正常對照組，差異具有顯著性(P<0.01)。不同體積的腫瘤之間血清HGF水平

3、存在顯著性差異(P<0.05)，腫瘤體積越大則血清HGF水平越高。c-Met蛋白在HCC組織上呈陽性表達，c-Met陽性染色主要定位于腫瘤細胞的胞膜和胞質，而在癌旁組織及正常組織呈弱陽性和低表達，差異具有顯著性意義，P<0.01。HCC組織c-Met陽性表達強度與腫瘤分化程度等密切相關，(P<0.05)。
　　結論：
　　1.HCC患者血清HGF水平較肝硬化及正常對照組明顯升高，差異具有顯著性。
　　2.HCC患者術前

4、血清HGF水平與腫瘤大小有明顯正相關性，腫瘤體積越大則血清HGF水平越高。
　　3.c-Met蛋白在HCC組織中表達強度明顯高于癌旁組織及正常肝組織，差異具有顯著性意義。
　　4.c-Met表達異常與HCC病理分化程度等密切相關。
　　第二部分 c-Met過表達細胞株構建及索拉非尼耐藥特征觀察
　　目的：評價c-Met過表達導致的細胞信號傳導異常對索拉非尼抑制肝癌細胞增殖的影響并尋找相應治療對策。
　　方法

5、：首先通過慢病毒載體將c-Met基因轉染至HepG2細胞，并使HepG2細胞能夠穩(wěn)定表達c-Met蛋白，通過嘌呤霉素篩選獲得穩(wěn)定轉染的細胞株HepG2-met。通過MTT比色法法及AnnexinV_FITC和PI雙染法檢測細胞周期及凋亡的方法，評價索拉非尼對HepG2細胞/HepG2-met細胞增殖影響是否存在差異，確定c-Met蛋白表達異常升高對索拉非尼抵抗作用。通過Western Blot方法檢測c-Met蛋白及其下游mTOR信號蛋

6、白P70S6K、4E-BP1磷酸化水平在HepG2細胞/HepG2-met細胞之間的差異，尋找c-Met蛋白表達異常升高對索拉非尼抵抗作用的分子機制。在此基礎上通過聯(lián)合mTOR抑制藥物雷帕霉素逆轉索拉非尼耐藥現象。
　　結果：通過RT-PCR檢測慢病毒感染的HtepG2細胞中c-Met mRNA確定慢病毒轉染MOI=20為最佳MOI值，通過2.5μg/ml嘌呤霉素持續(xù)作用10天篩選出抗嘌呤霉素的穩(wěn)定細胞株HepG2-met。Wes

7、tem blot方法分析c-Met的表達和磷酸化及mTOR信號途徑中P70S6K、4E-BP1蛋白磷酸化改變，顯示HepG2-met細胞在c-Met的表達和磷酸化及P70S6K、4E-BP1蛋白磷酸化水平上均明顯超過HepG2細胞。通過細胞生長曲線檢測發(fā)現HepG2-met具有較HepG2更為活躍的細胞增殖能力。MTT法檢測HepG2/HepG2-met細胞對索拉非尼增殖抑制敏感性：索拉非尼對HepG2/HepG2-met細胞增殖抑制作

8、用隨著藥物濃度的增加而逐漸增加，表現出劑量依賴性；HepG2-met具有一定的索拉非尼藥物作用抵抗特征。通過流式細胞術檢測可以看出HepG2-met細胞處于S期的比例為65.5％，較HepG2細胞的39.92％明顯升高，提示HepG2-met增殖更為活躍，在應用相同劑量的索拉非尼作用后HepG2-met細胞S期比例降至41.07％，細胞凋亡率為35.48％；HepG2細胞的S期比例降至25.89％，細胞凋亡率為63.42％，兩組間比較仍

9、有顯著性差異，提示索拉非尼對HepG2-met細胞增殖抑制作用有所下降，HepG2-met表現出對索拉非尼一定的耐藥性。當HepG2-met組聯(lián)合應用索拉非尼及小劑量的雷帕霉素后，S期比例降至32.03％，細胞凋亡率上升至65.01％，提示雷帕霉素可以部分逆轉HepG2-met細胞高表達c-Met造成的對索拉非尼一定耐藥性。
　　結論：
　　1.通過慢病毒轉染方式成功構建出c-Met過表達的HepG2-met細胞株，c-Me

10、t表達水平較HepG2明顯升高。
　　2.HepG2-met細胞株c-Met的表達和磷酸化水平升高，同時其下游信號如mTOR信號途徑中P70S6K、4E-BP1蛋白磷酸化較HepG2明顯升高。
　　3.HepG2-met細胞株具有較HepG2更為活躍的細胞增殖能力。
　　4.HepG2-met具有一定的索拉非尼藥物作用抵抗特征。
　　5.雷帕霉素通過抑制mTOR信號途徑中P70S6K、4E-BP1蛋白磷酸化可以部

11、分逆轉HepG2-metR寸索拉非尼的耐藥作用。
　　第三部分裸鼠荷人肝癌皮下模型的建立
　　目的：通過臨床肝癌標本建立裸鼠異種肝癌模型并對肝癌中HBV狀態(tài)作初步檢測。
　　方法：采集肝移植患者肝癌病理組織，種植于裸鼠皮下，經過多次傳代生長后，獲得可以穩(wěn)定生長與傳代的肝癌裸鼠模型。通過HE染色比較原代肝癌病例組織結構與多次傳代后的移植性肝癌模型的病理結果，評價異種肝癌模型是否具有與原代相似的病理組織學特征。同時通過PC

12、R方法檢測與HBV相關性肝癌的動物模型中HBV DNA存在狀態(tài)，初步探討HBV與HCC相關關系。
　　結果：成功建立4例肝癌動物模型。異種移植腫瘤標本和病人原發(fā)腫瘤標本的病理學形態(tài)相似，保留了原發(fā)腫瘤的部分組織形態(tài)學特性。4例肝癌異種移植物模型腫瘤標本分別進行HBV DNA的S區(qū)、C區(qū)和X區(qū)三個獨立區(qū)域檢測，結果一例標本S區(qū)、C區(qū)和X區(qū)均呈陽性，一例標本S區(qū)和X區(qū)呈陽性，一例標本S區(qū)和C區(qū)呈陽性。
　　結論：
　　1.