大鼠心梗模型中管家基因的選擇及ADAMTSs在心梗后心肌中的表達(dá)及機制.pdf

1、研究背景及目的
　　 基因表達(dá)分析在許多生命科學(xué)研究領(lǐng)域里的重要性日益增加，其研究的深入將為探索疾病相關(guān)基因、了解基因表達(dá)調(diào)控、解析生命奧秘、從而最終為人類服務(wù)大有裨益。反轉(zhuǎn)錄實時熒光聚合酶鏈反應(yīng)是對特定信使RNA進(jìn)行定量研究的最靈敏方法。為了分析特定信使RNA含量的差別，要用內(nèi)部參照基因來進(jìn)行定量。管家基因有幾百種，目前，作為內(nèi)參使用最廣泛的管家基因是3磷酸甘油醛脫氫酶、β肌動蛋白、18SrRNA和28SrRNA。教條地使用一

2、種管家基因或盲目參照不同實驗對象及條件所使用的管家基因作為內(nèi)參，一方面可能使基因表達(dá)的微小差異難以發(fā)現(xiàn)，另一方面可能導(dǎo)致錯誤甚至相反的結(jié)論。大鼠是一種常用制作心梗模型的實驗動物，對于冠心病相關(guān)基因的研究使用大鼠做動物模型是許多實驗室的首選。然而，心梗后大鼠內(nèi)參基因選擇問題還較少研究報道。
　　 心肌梗死是威脅人類生命的重大疾病，心肌梗死動物模型對于研究人類冠心病的發(fā)病機制、病理生理改變以及對治療方法的評估都具有重大意義。長期以來

3、實驗室研究是用結(jié)扎大鼠冠狀動脈的方法來制備模型，但在實踐中，由于麻醉和人工呼吸的使用不當(dāng)、肺損傷以及左冠狀動脈定位錯誤等各種原因，造成動物死亡或制模失敗。因此提高存活率及制模成功率是解決心肌梗死動物模型的一個核心問題。我們對制作大鼠心梗模型的方法加以改進(jìn)，明顯提高了大鼠的存活率，較好地解決了大鼠心梗模型的制備問題。
　　 急性心梗是引起人類死亡與殘疾的主要疾病之一。心梗后心室重塑可導(dǎo)致心衰與死亡率的增加。在心室重塑過程中包括細(xì)胞

4、外基質(zhì)(ECM)分子的集聚和降解的動態(tài)變化。許多生物物質(zhì)包括蛋白酶，蛋白酶抑制劑及生長因子等對ECM的重建起作用。其中基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPS)表達(dá)的增加與激活也牽涉其中。除基質(zhì)金屬蛋白酶外，還有一些蛋白酶家族可降解細(xì)胞外基質(zhì)。ADAMTS是一類分泌性金屬蛋白酶，其主要結(jié)構(gòu)包括解聚素，基質(zhì)金屬蛋白酶和血小板反應(yīng)素基序。在人類中其家族已發(fā)現(xiàn)19個成員，涉及裂解多種蛋白聚糖，膠原的代謝，抗血管新生，VWF多聚體的降解，以及胚胎器官發(fā)育，生殖

5、等多種功能。其中某些成員可與細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)合發(fā)揮作用。在頸動脈粥樣硬化斑塊及冠脈不穩(wěn)定斑塊中的富巨噬細(xì)胞區(qū)域ADAMTS4與8的表達(dá)增加，在動脈粥樣硬化發(fā)展過程中，ADAMTS4的表達(dá)上調(diào)。Versican是聚集蛋白聚糖家族成員之一，在組織中廣泛存在，參與傷口愈合及組織重塑過程。在冠脈結(jié)扎致心梗大鼠模型中其在心肌中表達(dá)并短暫升高，提示其參與了心梗后的炎癥反應(yīng)。ADAMTS4降解血管壁里的蛋白多聚糖versican，其作用位點在V1/VOv

6、ersican的Glu1428-Ala1429。ADAMTS4能被內(nèi)源性的抑制劑TIMPs阻斷，ADAMTS4和ADAMTS5均能被TIMP-3有效抑制，而對TIMP-1，2，4卻基本上不敏感。
　　 近年來ADAMTS在炎癥及動脈粥樣硬化中的作用得到關(guān)注。免疫組化分析示ADAMTS1、4、5、8在人類頸動脈病變及冠脈粥樣硬化斑塊處表達(dá)，ADAMTS4、5、8與巨噬細(xì)胞共存而ADAMTS1與內(nèi)皮細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞共存。Versic

7、an在組織中廣泛分布，亦存在于心臟中。versican在心梗后心臟中表達(dá)增高且其來源于滲出的單核細(xì)胞，提示其參與心梗后炎癥反應(yīng)。Aggrecan是一個軟骨特異性的硫酸軟骨素蛋白多聚糖，是ADAMTS的作用底物。ADAMTS4及5表現(xiàn)為較強的降解aggrecan活性。ADAMTS4在心梗后心臟中的具體表達(dá)部位，是否與versican在同一部位表達(dá)以及心梗后是否涉及aggrecan的表達(dá)，目前尚不明確。
　　 在剪切應(yīng)力作用下，人靜

8、脈內(nèi)皮細(xì)胞及心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞的ADAMTS1mRNA表達(dá)上調(diào)。在動脈粥樣硬化斑塊內(nèi)膜及增殖/遷移的主動脈血管平滑肌細(xì)胞中，ADAMTS1的mRNA表達(dá)增高。應(yīng)用INF-γ、TNF-α及IL-β刺激巨噬細(xì)胞發(fā)現(xiàn)INF-γ刺激后ADAMTS4、7、8、9表達(dá)增加，ADAMTS1及17表達(dá)下降，而ADAMTS2、5、10不受其影響，TNF-α刺激后ADAMTS4、7、8表達(dá)增加，ADAMTS9輕微升高，IL-1β刺激對ADAMTS4、7、8

9、表達(dá)無影響，而ADAMTSI及9在早期升高，說明ADAMTS家族中不同成員表達(dá)及調(diào)控機制存在差異。
　　 以往研究提示，在動脈硬化發(fā)展及動脈粥樣硬化斑塊不穩(wěn)定的過程中，ADAMTS4扮演著重要角色;ADAMTS4可以作為一種預(yù)示斑塊不穩(wěn)定及急性冠脈綜合征嚴(yán)重程度的指標(biāo)。經(jīng)皮冠脈介入治療(PCI)過程可以看作為機械擠壓誘導(dǎo)斑塊破裂的模型，因此研究PCI過程中的炎癥反應(yīng)或許可以為斑塊不穩(wěn)定機制提供線索。許多臨床研究報道了冠心病患者P

10、CI后的炎癥反應(yīng)。既然ADAMTS4已被證明是炎癥調(diào)節(jié)酶且與動脈硬化的發(fā)展及斑塊不穩(wěn)定相關(guān)，我們猜測在冠心病患者冠脈循環(huán)中ADAMTS4水平可能升高且受PCI手術(shù)影響。
　　 本研究用反轉(zhuǎn)錄實時熒光聚合酶鏈反應(yīng)方法比較了四種管家基因在心梗大鼠心臟中的表達(dá)情況，采用GeNorm算法分析了哪些管家基因最適于心梗后大鼠基因表達(dá)研究。改進(jìn)了大鼠心梗模型的制作方法，提高了手術(shù)成功率及大鼠存活率。探討了ADAMTS4、ADAMTS8、ver

11、sican、TIMP3在大鼠心梗后心臟中表達(dá)的動態(tài)變化、分布區(qū)域及可能機制，進(jìn)一步認(rèn)識急性心梗后局部ECM分子的變化及相互作用，為治療提供新的理論依據(jù)。檢測了IL-1β刺激內(nèi)皮細(xì)胞后ADAMTSs的表達(dá)趨勢。通過從冠狀靜脈竇取血檢測了冠脈ADAMTS4及hs-CRP水平，并評估了PCI對ADAMTS4及hs-CRP水平的影響。本學(xué)位論文的主要研究內(nèi)容及實驗結(jié)果如下:
　　 一、大鼠心梗模型中管家基因的選擇
　　 我們采用

12、結(jié)扎冠脈前降支的方法制作心梗模型，結(jié)合實際工作，分析并挑選出使用廣泛的4個標(biāo)準(zhǔn)管家基因:3磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)、核糖體蛋白L13A(RPL13A)、β-肌動蛋白(ACTB)和結(jié)合區(qū)連接蛋白(ARBP)，用反轉(zhuǎn)錄實時熒光聚合酶鏈反應(yīng)方法比較了它們在心梗大鼠心臟中的表達(dá)情況，采用GeNorm算法分析哪些管家基因最適于心梗后大鼠基因表達(dá)的研究。結(jié)果示RPL13A、GAPDH、ARBP及ACTB基因的M值分別為0.812、0.721、

13、0.812和1.2，分析得出GAPDH及ARBP是在心梗模型中表達(dá)最穩(wěn)定的基因。
　　 二、大鼠心肌梗死模型制備的改進(jìn)
　　 選取健康雄性Wistar大鼠100只(體重230-270g)，分為模型組(n=80)和假手術(shù)組(n=20)。3％戊巴比妥鈉(40mg/kg)腹腔注射麻醉，氣管切開，小動物呼吸機輔助呼吸，采用容量控制模式，潮氣量3ml/100g，呼吸頻率60-70次/min，吸呼比1∶1。左側(cè)胸部開胸，由第4肋間入

14、胸，用乳突牽開器牽開肋骨，暴露心臟。在肺動脈圓錐和左心耳之間距主動脈根部約3mm處結(jié)扎左冠狀動脈前降支。觀察心電圖變化，以肢體導(dǎo)聯(lián)2個以上導(dǎo)聯(lián)ST段抬高，或者肉眼觀察結(jié)扎處下方大面積心肌表面變得蒼白，周圍瘀血征出現(xiàn)，室壁搏動減弱為結(jié)扎成功標(biāo)準(zhǔn)。假手術(shù)組大鼠只穿線不結(jié)扎。逐層關(guān)胸，撤除呼吸機，拔除氣管插管。為防止氣道狹窄及分泌物導(dǎo)致窒息，不縫合氣管及頸部切口。術(shù)中至術(shù)后12h采用40W燈泡照射保暖，術(shù)后4h內(nèi)注意觀察氣管切口處分泌物，及時

15、用吸痰管清除。結(jié)果示心肌梗死模型制作的成功率為98.6％。模型組術(shù)后3周成活率為88.75％，假手術(shù)組存活率為100％。
　　 通過對大鼠心梗模型制作方法的改進(jìn)，提高了手術(shù)成功率及大鼠存活率。
　　 三、大鼠心梗后心肌中ADAMTS4、ADAMTS8、versican、TIMP-3基因表達(dá)的動態(tài)變化
　　 選擇250-300g雄性Wistar大鼠。按前述方法制作心梗模型，設(shè)假手術(shù)組。分別于手術(shù)后0、3、6、12、

16、24小時及3、7、14、21天(n=5)過量麻醉處死大鼠，迅速開胸摘取心臟，將結(jié)扎點下方梗死部位心肌分離切割，放入-70°C冰箱備用。用實時熒光定量RT-PCR方法分析梗死心肌中ADAMTS4、ADAMTS8、versican及TIMP-3mRNA表達(dá)，ELISA法檢測ADAMTS4的蛋白表達(dá)。結(jié)果示ADAMTS4表達(dá)在心梗后6及12小時明顯升高(p＜0.05)，隨后快速下降。而ADAMTS8則在心梗后6小時開始升高，至24小時達(dá)峰值，

17、3天時仍持續(xù)在高水平(p＜0.05)，然后緩慢下降。心梗后versicanmRNA水平顯著增高，至3天時達(dá)峰值，且升高持續(xù)時間較長。TIMP3表達(dá)水平降低。ADAMTS4蛋白水平在心梗后6小時(p=0.026)、12小時(p=0.003)、24小時(p=0.002)及3天(p=0.009)顯著增高。
　　 ADAMTS4、ADAMTS8，versican及TIMP-3在心梗大鼠心臟中表達(dá)，且表現(xiàn)為不同的動態(tài)變化趨勢。ADAMTS

18、4、versican及TIMP-3的表達(dá)之間存在相互關(guān)系。
　　 四、ADAMTS4在梗死大鼠心臟血管內(nèi)皮細(xì)胞及心肌細(xì)胞中表達(dá)
　　 選擇250-300g雄性Wistar大鼠制作心梗模型，設(shè)假手術(shù)組。手術(shù)后3天處死大鼠，取左心室制作冰凍切片。切片厚度為5um。免疫組織化學(xué)方法檢測ADAMTS4、versican及aggrecan蛋白表達(dá)。對于陰性對照組，我們以等比稀釋度用兔IgG處理切片。結(jié)果示ADAMTS4在梗死邊緣區(qū)

19、域心肌細(xì)胞中表達(dá)，在梗死區(qū)域及遠(yuǎn)離梗死區(qū)的正常心肌未見ADAMTS4表達(dá)。在梗死周圍區(qū)域毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞ADAMTS4有弱表達(dá)，versican強表達(dá)。Aggrecan在心梗組及假手術(shù)組的心肌組織及血管內(nèi)膜均未見表達(dá)。
　　 ADAMTS4與versican共同表達(dá)于內(nèi)皮細(xì)胞提示二者存在某種聯(lián)系，其動態(tài)變化可能在心梗后基質(zhì)重塑中起作用。
　　 五、白介素1β刺激內(nèi)皮細(xì)胞后ADAMTSs的表達(dá)
　　 選取人臍靜脈血

20、管內(nèi)皮細(xì)胞，以傳代培養(yǎng)法培養(yǎng)細(xì)胞。分別以2.5ng/ml，5ng/ml，10ng/ml，20ng/ml濃度的IL-1β刺激內(nèi)皮細(xì)胞，24h后收集細(xì)胞提取總RNA及蛋白。用10ng/mlIL-1β刺激內(nèi)皮細(xì)胞，分別于刺激后2h、6h、12h、24h、48h收集細(xì)胞提取總RNA及蛋白，設(shè)空白對照組，每組5個樣本。RT-PCR測定ADAMTS1、4、8、9、15mRNA表達(dá)，Western-blot測定ADAMTS4蛋白表達(dá)。結(jié)果示IL-1β

21、刺激內(nèi)皮細(xì)胞后ADAMTS1、4、8、9、15mRNA表達(dá)均增高，但隨時間變化趨勢不同，ADAMTS4蛋白表達(dá)增高。
　　 此結(jié)果提示ADAMTSs參與炎癥反應(yīng)，具體機制有待進(jìn)一步闡明。
　　 六、冠心病患者冠脈血中ADAMTS4水平的變化及經(jīng)皮冠脈介入治療對冠脈ADAMTS4水平的影響
　　 根據(jù)冠脈造影結(jié)果，將81例患者分為對照組、簡單病變組及復(fù)雜病變組，其中35例患者接受了PCI治療。血液檢測標(biāo)本從冠狀靜脈

22、竇獲得。ADAMTS4及hs-CRP值分別通過ELISA及免疫濁度法檢測。結(jié)果示復(fù)雜病變組ADAMTS4及hs-CRP值明顯高于對照組及簡單病變組(P＜0.001)。所有研究對象及冠心病患者的ADAMTS4水平均與hs-CRP水平相關(guān)(r1=0.73，r2=0.763，P＜0.01)。接受了PCI治療的患者ADAMTS4值高于未接受PCI者(P＜0.001)，hs-CRP亦表現(xiàn)出相似結(jié)果(P=0.025)。
　　 冠心病患者冠脈