金屬硫蛋白對皮瓣缺血再灌注損傷時相關凋亡基因Caspase-3表達影響的實驗研究.pdf

1、目的：在建立大鼠腹部皮瓣缺血再灌注損傷模型的基礎上，采用半定量反轉錄-聚合酶鏈反應(reverse transcriptase-polymerase chain reaction， RT-PCR)、免疫組織化學法，并應用外源性葡萄糖酸鋅誘導體內(nèi)MT生成，觀察大鼠皮瓣缺血再灌注組織中不同時間點細胞凋亡及Caspase-3基因和蛋白的表達，探討MT對缺血再灌注損傷相關基因Caspase-3表達的影響，從基因水平闡明MT對缺血再灌注損傷皮瓣的

2、保護作用機理，對為防治各種組織瓣移植中出現(xiàn)的缺血再灌注損傷，提高組織瓣移植成活率的臨床研究，提供新的思路和理論依據(jù)。
　　 方法：
　　 1.實驗動物：雄性健康清潔級Wistar大鼠120只，稱重，編號。
　　 2.實驗動物分組：把120只大鼠隨機分為三組：(1)實驗A組（缺血再灌注組）(2)實驗B組（給藥組）(3)對照組，每組40只，各組按5個時間點再分為5組，每組8只大鼠。
　　 3.皮瓣制備方法：2

3、％戊巴比妥鈉（40mg/kg）腹腔注射麻醉，每3小時追加一次(20mg/kg)以維持麻醉，大鼠仰臥，四肢固定，剪除腹毛，75％酒精消毒，按照Petry JJ等描述的方法，于右下腹設計一以腹壁淺血管為蒂的軸形皮瓣，大小為6cm×3cm。對照組在皮瓣形成后原位縫合，不做其他處理；實驗A組在皮瓣形成后，用微血管夾夾閉腹壁淺動脈發(fā)出點近端的股動脈，在手術顯微鏡下確認股動脈和腹壁淺動脈被完全阻斷，皮瓣原位縫合，8小時后再次手術去除血管夾；實驗B組

4、于術前24小時，向大鼠管飼葡萄糖酸鋅140mg/Kg，其余操作同實驗A組。
　　 4.取材：實驗A組和B組的40只大鼠于掀起皮瓣后即刻、再灌注后1小時、6小時、12小時和24小時分別于皮瓣中段邊緣取全層皮瓣組織1cm×0.5cm，對照組分別于掀起皮瓣即刻、術后9小時、14小時、20小時和32小時取材。所取組織一半用4％多聚甲醛固定，行免疫組化檢測；另一半超低溫冰凍保存，制作單細胞懸液，以備Caspase-3 mRNA檢測。

5、>　　 5.檢測方法及指標：(1) HE染色切片，光鏡下進行組織病理學觀察。細胞核呈藍色，胞漿呈粉紅色，肌纖維及膠原纖維呈紅色。(2)免疫組化檢測及評分：對石蠟切片進行SP法免疫組化染色，步驟嚴格按照試劑盒說明書進行，光鏡下觀察Caspase-3蛋白的分布和著色深淺程度，陽性與陰性對照同時進行，陽性信號以胞質或胞膜有棕黃色或棕褐色顆粒為判定標準。免疫組化評分(immunohistochemical scores，IHS)方法參照文獻，

6、結合陽性細胞百分比及陽性細胞染色強弱兩個方面評分：a為陽性細胞百分比(無陽性細胞=0，陽性細胞占1-10％=1，11-50％=2，51-80％=3，81-100％=4)，b為陽性細胞染色強弱（陰性=0，弱陽性=1，中度陽性=2，強陽性=3），a，b兩項乘積即為該例組織的IHS。(3)逆轉錄，多聚酶鏈反應法（reverse transcription，RT-PCR）半定量檢測Caspase-3 mRNA水平：根據(jù)文獻報道設計引物序列，由北

7、京塞百盛基因技術有限公司合成。引物序列：Caspase-3上游引物：5｀- AAGCCGAAACTCTTCATC-3｀，Caspase-3下游引物：5｀- TGAGCATTGACACAATACAC-3｀。β-actin上游引物：5｀- TCCTGACCCTGAAGTACCCCATTG-3｀，β-actin下游引物：5｀- GGAACCGCTCATTGCCGATAGT-3｀。按Trizol RNA提取試劑盒說明書提取細胞總RNA，RNA保

8、存在-80℃，用紫外分光光度吸收法測定RNA的含量。然后進行逆轉錄和PCR擴增反應，取每個標本的擴增產(chǎn)物于瓊脂糖凝膠電泳，以DNA Marker(DL2000)作為標準片段標記，電泳后以紫外透射儀觀察，并用數(shù)碼相機照相，輸入微機應用凝膠圖象分析系統(tǒng)對目的電泳條帶進行分析，以相應的內(nèi)參電泳條帶作為參照，結果以兩者之積分吸光度的比值表示。
　　 6.統(tǒng)計學處理：用SPSS13.0統(tǒng)計學處理軟件，對不同類型數(shù)據(jù)進行不同的統(tǒng)計學處理。<

9、br>　　 結果：
　　 1.皮瓣缺血再灌注時的組織病理學變化：缺血再灌注后，實驗A組可見大多數(shù)細胞胞體縮小，核固縮，胞質嗜酸性深染，這種變化在再灌注后24小時尤為明顯。對照組的組織形態(tài)學結構基本正常，無上述變化。而實驗B組異常細胞均較實驗A組顯著減少，且受損程度較輕，多表現(xiàn)為細胞胞漿輕度深染，核固縮，仁消失者也少見。
　　 2.免疫組化染色結果：染色主要位于胞漿，呈棕黃色或棕褐色。光鏡下觀察，Caspase-3陽性細

10、胞主要在皮瓣組織的上皮基底細胞層、成纖維細胞、毛囊、汗腺、皮脂腺及血管內(nèi)皮細胞中，和凋亡細胞的分布區(qū)域基本相同。對照組可見少量、散在分布的Caspase-3陽性細胞，面積小，染色淺，表達微弱；實驗A組Caspase-3陽性細胞表達隨缺血再灌注時間延長呈逐漸增強趨勢，并在缺血再灌注24小時后達高峰。可見連成線片狀，染色最深，表達最強；而實驗B組則較A組表達明顯減弱。正常對照組與實驗A組和實驗B組表達比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。免

11、疫組化染色評分：結果顯示，實驗A組的陽性細胞表達隨時間增長逐級增強，與對照組相比有顯著差異(P＜0.01)，再灌注后24小時達高峰。實驗B組雖然也逐漸增強，但是相鄰時間點之間并無顯著差異(P＞0，05)。但實驗 A組和實驗B組之間陽性細胞表達差異明顯(P＜0.01)，說明應用葡萄糖酸鋅后產(chǎn)生的金屬硫蛋白對Caspase-3活性表達有一定抑制作用。
　　 3.RT-PCR法測Caspase-3 mRNA水平：根據(jù)PCR-Marke

12、r所示，RT-PCR結果顯示所擴增的Caspase-3基因片段大小約為349 bp，內(nèi)參B-Actin基因片段大小約576 bp，與目標片段大小一致，提示均為特異性擴增。對照組 Caspase-3 mRNA有少量表達。實驗A組在掀起皮瓣即刻、缺血再灌注1 h和再灌流6h后，Caspase-3 mRNA表達明顯增加，以后隨著再灌注時間的延長，表達逐漸增強，至再灌注24h達高峰，以后增幅逐級減小(相鄰時間點比較P＜0.05)。在實驗B組中，

13、隨再灌注時間的延長，Caspase-3 mRNA表達活性雖然也在增加，但是與實驗A組相比其增幅顯著降低(P＜0.05)。
　　 結論：
　　 1.皮瓣缺血再灌注后，其組織內(nèi)出現(xiàn)Caspase-3活性增高，提示 Caspase-3參與了皮瓣組織缺血再灌注時細胞凋亡的調(diào)控過程。
　　 2.應用葡萄糖酸鋅后，皮瓣缺血再灌注后Caspase-3的表達活性有所下降，進一步證實Caspase-3確實參與了皮瓣組織細胞凋亡過程