缺血再灌注損傷對皮瓣細(xì)胞凋亡相關(guān)基因p53表達(dá)的影響.pdf_第1頁
已閱讀1頁,還剩49頁未讀, 繼續(xù)免費閱讀

下載本文檔

版權(quán)說明:本文檔由用戶提供并上傳,收益歸屬內(nèi)容提供方,若內(nèi)容存在侵權(quán),請進(jìn)行舉報或認(rèn)領(lǐng)

文檔簡介

1、目的:應(yīng)用分子生物學(xué)及免疫組化方法,研究皮瓣組織缺血再灌注(ischemia-reperfusion I/R)損傷不同時間點相關(guān)凋亡基因p53表達(dá)的變化規(guī)律,探討缺血再灌注損傷對皮瓣組織細(xì)胞凋亡及相關(guān)基因p53表達(dá)的影響,從基因水平,為臨床上減輕直至消除皮瓣組織缺血再灌注損傷、提高皮瓣移植成活率,從調(diào)控細(xì)胞凋亡角度開辟新的治療途徑。
   方法:
   1.實驗動物:健康Wister大鼠40只,稱重,編號。
  

2、 2.實驗動物分組:將大鼠隨機(jī)分為2組,即對照組(非缺血再灌注組)和實驗組(缺血再灌注組),每組20只,每組分為5個時間點取材,每個時間點4只。
   3.皮瓣制備方法:2%戊巴比妥鈉(40mg/kg)腹腔注射麻醉,每3小時追加一次(20mg/kg)以維持麻醉,大鼠仰臥,四肢固定,剪除腹毛,75%酒精消毒,按照Petry JJ等描述的方法,于右下腹設(shè)計一以腹壁淺血管為蒂的軸形皮瓣,大小為6cm×3cm。對照組即非IR組:按上述方

3、法制備皮瓣,皮瓣形成后原位縫合,不做其他處理;實驗組即IR組:按上述方法制備皮瓣,皮瓣形成后,用微血管夾夾閉腹壁淺動脈發(fā)出點近端的股動脈,8小時后手術(shù)去除血管夾。
   4.取材:對照組的20只大鼠于掀起皮瓣即刻、9h、14h、20h、32h分別于皮瓣中段邊緣取全層皮瓣組織1cm×0.5cm,實驗組的20只大鼠于術(shù)后即刻、1h、6h、12h、24 h同法取材。將所取組織一部分置于4%多聚甲醛溶液中固定,及時制成石蠟切片,待做HE

4、染色、免疫組化染色;將另一部分組織(約100mg)于液氮箱保存,備p53 mRNA檢測。
   5.檢測方法及指標(biāo):
   (1)將石蠟切片進(jìn)行HE染色,觀察組織結(jié)構(gòu)改變。
   (2)免疫組化檢測及評分:對石蠟切片進(jìn)行SP法免疫組化染色,染色步驟遵照試劑盒說明書進(jìn)行,光鏡下觀察p53蛋白的分布和著色深淺程度,陽性與陰性對照同時進(jìn)行,陽性信號以胞漿或胞膜有棕黃色或棕褐色顆粒為判斷。免疫組化評分(immunohis

5、tochemical scores IHS)方法參照文獻(xiàn),結(jié)合陽性細(xì)胞百分比及陽性細(xì)胞染色強(qiáng)弱兩個方面評分:a為陽性細(xì)胞百分比(無陽性細(xì)胞=0,陽性細(xì)胞占1-10%=1,11-50%=2,51-80%=3,81-100%=4),b為陽性細(xì)胞染色強(qiáng)弱(陰性=0,弱陽性=1,中度陽性=2,強(qiáng)陽性=3),a,b兩項乘積即為該例組織的IHS。
   (3)逆轉(zhuǎn)錄-多聚酶鏈反應(yīng)法(reverse transcription,RT-PCR)

6、半定量檢測p53 mRNA水平:依據(jù)文獻(xiàn)報道設(shè)計引物。引物序列:p53上游引物:5’- CAGCCAAGTCTGTGACTTGCACGTAC-3’,p53下游引物5’-CTGTGCCGAAAAGTCTGCCTGTCGTC-3’。β-actin上游引5’-TCCTGACCCTGAAGTACCCCATTG-3’,β-actin下游引物:5’- GGAACCGCTCATTGCCGATAGT-3’。按Trizol RNA提取試劑盒說明書提取細(xì)胞

7、總RNA,RNA保存在液氮中,電泳后于紫外透射儀觀察,數(shù)碼相機(jī)照相后輸入微機(jī),應(yīng)用凝膠圖象分析系統(tǒng)對目的電泳條帶進(jìn)行分析,以相應(yīng)的內(nèi)參電泳條帶作為參照,結(jié)果以兩者之積分吸光度的比值表示。
   6.統(tǒng)計學(xué)處理:用SPSS13.0統(tǒng)計學(xué)處理軟件,對不同類型數(shù)據(jù)進(jìn)行不同的統(tǒng)計學(xué)處理。
   結(jié)果:
   1.HE染色組織學(xué)檢查:非-IR組各時段皮下組織水腫輕,組織內(nèi)炎性細(xì)胞浸潤少見,細(xì)胞排列整齊。IR組術(shù)后1h,組織

8、出現(xiàn)充血、水腫,表皮角質(zhì)層開始出現(xiàn)局部破損,血管擴(kuò)張,可見散在的局灶性中性粒細(xì)胞浸潤,6h皮下組織水腫嚴(yán)重,皮膚各層結(jié)構(gòu)疏松、紊亂,在血管周圍可見大量中性粒細(xì)胞粘附、聚集,有大量白細(xì)胞、紅細(xì)胞滲出到組織間隙;24h原有情況繼續(xù)加重,中性粒細(xì)胞進(jìn)一步增多,血管的完整性破壞,皮膚壞死程度較重,結(jié)構(gòu)不清。(圖1~4)。
   2.實驗組術(shù)后即刻,再灌注1h、6h、12h、24h中p53相對表達(dá)量分別為(表5):(0.132±0.011

9、)、(0.262±0.0528)、(0.371±0.057)、(0.467±0.068)和(0.552±0.047)。實驗組在皮瓣缺血再灌注損傷后,p53mRNA的變化隨著缺血再灌注時間的延長,該基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平逐漸增高,至再灌注后24小時達(dá)到高峰,且實驗組明顯高于對照組(P<0.05)。
   3.免疫組化結(jié)果:光鏡下觀察,p53陽性細(xì)胞染色呈棕黃色或棕褐色。非IR組和IR組術(shù)后即刻,偶見p53蛋白表達(dá)在血管壁細(xì)胞,IR組術(shù)后

10、9 h和33 h見上皮基底層細(xì)胞、皮下組織成纖維細(xì)胞、血管壁細(xì)胞、毛囊少量陽性細(xì)胞表達(dá)。 IR組再灌注1 h上皮基底層細(xì)胞、皮下組織成纖維細(xì)胞、血管壁細(xì)胞、毛囊、皮脂腺和汗腺均有陽性表達(dá),再灌注6h、12h、24 h p53蛋白表達(dá)部位與再灌注1h相同,但陽性細(xì)胞數(shù)呈上升趨勢,陽性表達(dá)強(qiáng)度增加,(P<0.05)。
   結(jié)論:
   皮瓣組織發(fā)生缺血再灌注損傷誘導(dǎo)時p53表達(dá)增加,這說明調(diào)亡相關(guān)基因p53參與缺血再灌注損

溫馨提示

  • 1. 本站所有資源如無特殊說明,都需要本地電腦安裝OFFICE2007和PDF閱讀器。圖紙軟件為CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.壓縮文件請下載最新的WinRAR軟件解壓。
  • 2. 本站的文檔不包含任何第三方提供的附件圖紙等,如果需要附件,請聯(lián)系上傳者。文件的所有權(quán)益歸上傳用戶所有。
  • 3. 本站RAR壓縮包中若帶圖紙,網(wǎng)頁內(nèi)容里面會有圖紙預(yù)覽,若沒有圖紙預(yù)覽就沒有圖紙。
  • 4. 未經(jīng)權(quán)益所有人同意不得將文件中的內(nèi)容挪作商業(yè)或盈利用途。
  • 5. 眾賞文庫僅提供信息存儲空間,僅對用戶上傳內(nèi)容的表現(xiàn)方式做保護(hù)處理,對用戶上傳分享的文檔內(nèi)容本身不做任何修改或編輯,并不能對任何下載內(nèi)容負(fù)責(zé)。
  • 6. 下載文件中如有侵權(quán)或不適當(dāng)內(nèi)容,請與我們聯(lián)系,我們立即糾正。
  • 7. 本站不保證下載資源的準(zhǔn)確性、安全性和完整性, 同時也不承擔(dān)用戶因使用這些下載資源對自己和他人造成任何形式的傷害或損失。

最新文檔

評論

0/150

提交評論