缺血再灌注損傷對皮瓣細(xì)胞凋亡相關(guān)基因p53表達(dá)的影響.pdf

1、目的：應(yīng)用分子生物學(xué)及免疫組化方法，研究皮瓣組織缺血再灌注(ischemia-reperfusion I/R)損傷不同時間點相關(guān)凋亡基因p53表達(dá)的變化規(guī)律，探討缺血再灌注損傷對皮瓣組織細(xì)胞凋亡及相關(guān)基因p53表達(dá)的影響，從基因水平，為臨床上減輕直至消除皮瓣組織缺血再灌注損傷、提高皮瓣移植成活率，從調(diào)控細(xì)胞凋亡角度開辟新的治療途徑。
　　 方法：
　　 1.實驗動物：健康Wister大鼠40只，稱重，編號。
　　

2、 2.實驗動物分組：將大鼠隨機(jī)分為2組，即對照組（非缺血再灌注組）和實驗組（缺血再灌注組），每組20只，每組分為5個時間點取材，每個時間點4只。
　　 3.皮瓣制備方法：2％戊巴比妥鈉(40mg/kg)腹腔注射麻醉，每3小時追加一次(20mg/kg)以維持麻醉，大鼠仰臥，四肢固定，剪除腹毛，75％酒精消毒，按照Petry JJ等描述的方法，于右下腹設(shè)計一以腹壁淺血管為蒂的軸形皮瓣，大小為6cm×3cm。對照組即非IR組：按上述方

3、法制備皮瓣，皮瓣形成后原位縫合，不做其他處理；實驗組即IR組：按上述方法制備皮瓣，皮瓣形成后，用微血管夾夾閉腹壁淺動脈發(fā)出點近端的股動脈，8小時后手術(shù)去除血管夾。
　　 4.取材：對照組的20只大鼠于掀起皮瓣即刻、9h、14h、20h、32h分別于皮瓣中段邊緣取全層皮瓣組織1cm×0.5cm，實驗組的20只大鼠于術(shù)后即刻、1h、6h、12h、24 h同法取材。將所取組織一部分置于4％多聚甲醛溶液中固定，及時制成石蠟切片，待做HE

4、染色、免疫組化染色；將另一部分組織(約100mg)于液氮箱保存，備p53 mRNA檢測。
　　 5.檢測方法及指標(biāo)：
　　 (1)將石蠟切片進(jìn)行HE染色，觀察組織結(jié)構(gòu)改變。
　　 (2)免疫組化檢測及評分：對石蠟切片進(jìn)行SP法免疫組化染色，染色步驟遵照試劑盒說明書進(jìn)行，光鏡下觀察p53蛋白的分布和著色深淺程度，陽性與陰性對照同時進(jìn)行，陽性信號以胞漿或胞膜有棕黃色或棕褐色顆粒為判斷。免疫組化評分(immunohis

5、tochemical scores IHS)方法參照文獻(xiàn)，結(jié)合陽性細(xì)胞百分比及陽性細(xì)胞染色強(qiáng)弱兩個方面評分：a為陽性細(xì)胞百分比(無陽性細(xì)胞=0，陽性細(xì)胞占1-10％=1，11-50％=2，51-80％=3，81-100％=4)，b為陽性細(xì)胞染色強(qiáng)弱（陰性=0，弱陽性=1，中度陽性=2，強(qiáng)陽性=3），a，b兩項乘積即為該例組織的IHS。
　　 (3)逆轉(zhuǎn)錄-多聚酶鏈反應(yīng)法(reverse transcription，RT-PCR)

6、半定量檢測p53 mRNA水平：依據(jù)文獻(xiàn)報道設(shè)計引物。引物序列：p53上游引物：5’- CAGCCAAGTCTGTGACTTGCACGTAC-3’，p53下游引物5’-CTGTGCCGAAAAGTCTGCCTGTCGTC-3’。β-actin上游引5’-TCCTGACCCTGAAGTACCCCATTG-3’，β-actin下游引物：5’- GGAACCGCTCATTGCCGATAGT-3’。按Trizol RNA提取試劑盒說明書提取細(xì)胞

7、總RNA，RNA保存在液氮中，電泳后于紫外透射儀觀察，數(shù)碼相機(jī)照相后輸入微機(jī)，應(yīng)用凝膠圖象分析系統(tǒng)對目的電泳條帶進(jìn)行分析，以相應(yīng)的內(nèi)參電泳條帶作為參照，結(jié)果以兩者之積分吸光度的比值表示。
　　 6.統(tǒng)計學(xué)處理:用SPSS13.0統(tǒng)計學(xué)處理軟件，對不同類型數(shù)據(jù)進(jìn)行不同的統(tǒng)計學(xué)處理。
　　 結(jié)果：
　　 1.HE染色組織學(xué)檢查：非-IR組各時段皮下組織水腫輕，組織內(nèi)炎性細(xì)胞浸潤少見，細(xì)胞排列整齊。IR組術(shù)后1h，組織

8、出現(xiàn)充血、水腫，表皮角質(zhì)層開始出現(xiàn)局部破損，血管擴(kuò)張，可見散在的局灶性中性粒細(xì)胞浸潤，6h皮下組織水腫嚴(yán)重，皮膚各層結(jié)構(gòu)疏松、紊亂，在血管周圍可見大量中性粒細(xì)胞粘附、聚集，有大量白細(xì)胞、紅細(xì)胞滲出到組織間隙；24h原有情況繼續(xù)加重，中性粒細(xì)胞進(jìn)一步增多，血管的完整性破壞，皮膚壞死程度較重，結(jié)構(gòu)不清。(圖1～4)。
　　 2.實驗組術(shù)后即刻，再灌注1h、6h、12h、24h中p53相對表達(dá)量分別為(表5):(0.132±0.011

9、)、(0.262±0.0528)、(0.371±0.057)、(0.467±0.068)和(0.552±0.047)。實驗組在皮瓣缺血再灌注損傷后，p53mRNA的變化隨著缺血再灌注時間的延長，該基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平逐漸增高，至再灌注后24小時達(dá)到高峰，且實驗組明顯高于對照組(P＜0.05)。
　　 3.免疫組化結(jié)果：光鏡下觀察，p53陽性細(xì)胞染色呈棕黃色或棕褐色。非IR組和IR組術(shù)后即刻，偶見p53蛋白表達(dá)在血管壁細(xì)胞，IR組術(shù)后

10、9 h和33 h見上皮基底層細(xì)胞、皮下組織成纖維細(xì)胞、血管壁細(xì)胞、毛囊少量陽性細(xì)胞表達(dá)。 IR組再灌注1 h上皮基底層細(xì)胞、皮下組織成纖維細(xì)胞、血管壁細(xì)胞、毛囊、皮脂腺和汗腺均有陽性表達(dá)，再灌注6h、12h、24 h p53蛋白表達(dá)部位與再灌注1h相同，但陽性細(xì)胞數(shù)呈上升趨勢，陽性表達(dá)強(qiáng)度增加，(P＜0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 皮瓣組織發(fā)生缺血再灌注損傷誘導(dǎo)時p53表達(dá)增加，這說明調(diào)亡相關(guān)基因p53參與缺血再灌注損