缺血再灌注損傷對(duì)皮瓣細(xì)胞凋亡及相關(guān)基因bcl-2表達(dá)的影響.pdf

1、目的：應(yīng)用分子生物學(xué)及免疫組化方法，研究皮瓣組織缺血再灌注(ischemia-reperfusion I/R)損傷不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞凋亡及相關(guān)基因bcl-2表達(dá)的變化規(guī)律，探討缺血再灌注損傷對(duì)皮瓣組織細(xì)胞凋亡及相關(guān)基因bcl-2表達(dá)的影響，為臨床上減輕直至消除皮瓣組織缺血再灌注損傷、提高皮瓣移植成活率，從調(diào)控細(xì)胞凋亡角度開(kāi)辟新的治療途徑。 方法：1、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：雄性健康Wister大鼠40只，稱(chēng)重，編號(hào)。2、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組：將大鼠隨機(jī)分

2、為五組，即對(duì)照組(Ⅰ組)、再灌注2小時(shí)組(Ⅱ組)、再灌注6小時(shí)組(Ⅲ組)、再灌注12小時(shí)組(Ⅳ組)和再灌注24小時(shí)組(Ⅴ組)，每組8只。3、皮瓣制備方法：2％戊巴比妥鈉(40mg/kg)腹腔注射麻醉，每3小時(shí)追加一次(20mg/kg)以維持麻醉，大鼠仰臥，四肢固定，剪除腹毛，75％酒精消毒，按照PetryJJ等描述的方法，于右下腹設(shè)計(jì)一以腹壁淺血管為蒂的軸形皮瓣，大小為6cm×3cm。Ⅰ組：按上述方法制備皮瓣，皮瓣形成后原位縫合，不做其

3、他處理：Ⅱ組、Ⅲ組、Ⅳ組和Ⅴ組：按上述方法制備皮瓣，皮瓣形成后，用微血管夾夾閉腹壁淺動(dòng)脈發(fā)出點(diǎn)近端的股動(dòng)脈，8小時(shí)后手術(shù)去除血管夾。4、取材：Ⅰ組在皮瓣形成后即刻于皮瓣中段邊緣取全層皮瓣組織2cm×1cm；Ⅱ組于再灌注后2小時(shí)用同樣方法取材；Ⅲ組于再灌注后6小時(shí)取材；Ⅳ組于再灌注后12小時(shí)取材；V組于再灌注后24小時(shí)取材。將所取組織一部分置于4％多聚甲醛溶液中固定，及時(shí)制成石蠟切片，待做免疫組化染色和細(xì)胞凋亡原位末端標(biāo)記；將另一部分組織

4、(約100mg)于-80℃冰箱保存，備Bcl-2 mRNA檢測(cè)。5、檢測(cè)方法及指標(biāo)：(1)凋亡細(xì)胞原位末端標(biāo)記(TUNEL法)與半定量分析：對(duì)皮瓣組織石蠟切片采用TUNEL法原位標(biāo)記DNA片段檢測(cè)凋亡細(xì)胞，操作方法嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，光鏡下觀(guān)察凋亡細(xì)胞的分布，陽(yáng)性細(xì)胞可見(jiàn)細(xì)胞核呈棕黃色。根據(jù)凋亡陽(yáng)性細(xì)胞分布情況，每張切片于40倍目鏡下隨機(jī)拍攝5個(gè)陽(yáng)性視野，每視野記數(shù)300個(gè)細(xì)胞中陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞數(shù)目及總細(xì)胞數(shù)目，以陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)所占

5、總細(xì)胞數(shù)的百分比作為凋亡細(xì)胞陽(yáng)性指數(shù)(AI，AI=凋亡細(xì)胞數(shù)目/總細(xì)胞數(shù)目×100％)。(2)逆轉(zhuǎn)錄-多聚酶鏈反應(yīng)法(reverse transcription，RT-PCR)半定量檢測(cè)Bcl-2 mRNA水平：依據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道設(shè)計(jì)引物，由上海生物工程公司合成。引物序列：Bcl-2上游引物：5’-CAAGAATGCAAAGCACATCC-3’，Bcl-2下游引物：5’-ATCCCAGCCTCCGTTATCC-3’。β-actin上游引物：5

6、’-GCCATGTACGTAGCCATCCA-3’，β-actin下游引物：5’-GAACCGCTCATTGCCGATAG-3’。按Trizol RNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取細(xì)胞總RNA，RNA保存在-80℃，用紫外分光光度吸收法測(cè)定RNA的含量。然后進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增反應(yīng)，Bcl-2 mRNA的相對(duì)含量用β-actin條帶灰度值標(biāo)化后的Bcl-2條帶灰度值表示。(3)免疫組化檢測(cè)及評(píng)分：對(duì)石蠟切片進(jìn)行SP法免疫組化染色，步驟嚴(yán)格按照

7、試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，光鏡下觀(guān)察Bcl-2蛋白的分布和著色深淺程度，陽(yáng)性與陰性對(duì)照同時(shí)進(jìn)行，陽(yáng)性信號(hào)以胞質(zhì)或胞膜有棕黃色或棕褐色顆粒為判斷。免疫組化評(píng)分(immunohistochemicalscores IHS)方法參照文獻(xiàn)，結(jié)合陽(yáng)性細(xì)胞百分比及陽(yáng)性細(xì)胞染色強(qiáng)弱兩個(gè)方面評(píng)分：a為陽(yáng)性細(xì)胞百分比(無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞=0，陽(yáng)性細(xì)胞占1-10％=1，11-50％=2，51-80％=3，81-100％=4)，b為陽(yáng)性細(xì)胞染色強(qiáng)弱(陰性=0，弱陽(yáng)性=1，中

8、度陽(yáng)性=2，強(qiáng)陽(yáng)性=3)，a，b兩項(xiàng)乘積即為該例組織的IHS。6、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：用SAS6.12統(tǒng)計(jì)學(xué)處理軟件，對(duì)不同類(lèi)型數(shù)據(jù)進(jìn)行不同的統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。 結(jié)果：1、TUNEL法觀(guān)察細(xì)胞調(diào)亡情況：光鏡下觀(guān)察，TUNEL標(biāo)記DAB染色的陽(yáng)性細(xì)胞主要位于皮瓣組織的上皮基底層細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、毛囊、汗腺、皮脂腺及血管壁細(xì)胞中，皮下結(jié)締組織中也可見(jiàn)少量，染色主要位于胞核，呈棕黃色。其中Ⅰ組僅可見(jiàn)少量、散在的陽(yáng)性細(xì)胞；Ⅱ組～Ⅴ組陽(yáng)性細(xì)胞均較Ⅰ組明

9、顯增多，且Ⅱ組～Ⅴ組的TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)呈逐漸增強(qiáng)的趨勢(shì)。Ⅰ～Ⅴ組的AI分別為：(17.32±0.97)％、 (24.51±1.64)％、 (30.69±2.14)％、(35.42±2.3 1)％和(39.95±2.47)％，Ⅱ組～Ⅴ組與Ⅰ組比較差異顯著(P＜0.05)，且Ⅱ組～Ⅴ組的AI關(guān)系為：Ⅱ組＜Ⅲ組＜Ⅳ組＜Ⅴ組(P均＜0.05)。2、RT-PCR法測(cè)Bcl-2mRNA水平：PCR反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，UVP凝膠成像系統(tǒng)自

10、動(dòng)掃描，測(cè)各條帶吸光度(A)，以目的基因A與β-actin A的比值代表目的基因的相對(duì)表達(dá)量，Ⅰ～Ⅴ組的Bcl-2相對(duì)表達(dá)量分別為：(0.177±0.011)、(0.293±0.023)、(0.389±0.027)、 (0.507±0.036)和(0.403±0.031)。Ⅱ組～Ⅳ組較Ⅰ組表達(dá)明顯增強(qiáng)(P＜0.05)，Ⅱ組～Ⅳ組的表達(dá)關(guān)系為：Ⅱ組＜Ⅲ組＜Ⅳ組(P均＜0.05)：Ⅴ組較Ⅰ組表達(dá)明顯增強(qiáng)(P＜0.05)，但與Ⅳ組比較，表達(dá)減

11、弱(P＜0.05)。 3、免疫組化結(jié)果：光鏡下觀(guān)察，Bcl-2陽(yáng)性細(xì)胞主要分布于皮瓣組織的上皮基底層細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、毛囊、汗腺、皮脂腺及血管壁細(xì)胞中，與凋亡細(xì)胞的集中分布基本一致。染色主要位于胞漿，呈棕黃色或棕褐色。I～V組的Bcl-2陽(yáng)性細(xì)胞IHS分別為：(1.34±0.12)、(4.73±0.25)、(7.19±0.48)、 (9.62±0.71)、 (7.33±0.5 1)。II組～V組較I組表達(dá)均明顯增強(qiáng)(P＜0.05)，II